Alkion kantasolut

Löytö alkion kantasolujen - ei ollut onnettomuus, ja ilmestyi valmis maaperän tutkimuksen alalla kehitysbiologian tutkimukseen. Termi "kantasolu" otettiin lääketieteen vuonna 1908 Society of Hematologia kongressissa Berliinissä, Alexander Maksimov soveltaa hematopoieettisten solujen. Kauan ennen eristää ja valmistaa stabiilit linjat pluripotenttien alkion kantasolujen varhaisessa kehitysvaiheessa tutkimuksen käytetyn prosessin varsi epämuotoisuus (alkio-karsinooma-solujen, jotka tutkittiin tuntematon mekanismeja alkionkehityksen, mukaan lukien sekvenssi aikaisten geenien ilmentymiselle, ja proteiinituotteita työnsä.

Mutta onko ihmisen genomin totipotenssi, joka on peruuttamattomasti menetetty evoluutioprosessissa? Ei, ja alkioiden syntyminen on todiste. Jos näin on, silloin silloin, kun evolutionaarisen kehityksen toinen tie toteutuu periaatteessa? Todennäköisesti, kun henkilö lähtee kosmoksesta, jossa ympäristön olosuhteet ovat melko pitkät. Luukato (luun demineralisoitumista Painottomissa tilassa) hyvin hitaasti myöntyväinen remodeling ja palautuminen voidaan pitää ensimmäinen askel ihmisen Sopeutumisaikaa lajina olemassaolon avaruudessa. Tulevaisuuden evoluutiokehityksen toisen polun maksaminen on kuitenkin erilainen - steriliteetti on hinta, joka palautetaan takaisin kaikille totipotentiaalisille soluille ja absoluuttiselle plastisuudelle. Joten moninkertaistaa tässä maailmassa "evoluutiokameleeleista" ei ole meioosia, otpochkovaniem. Mutta me elämme kauan. Telomeraasi kuolemattomuus on amoabin kuolemattomuus. Monisoluisessa organismissa kantasolut ovat kvantitatiivisen ja laadullisen pitkäikäisyyden substraatti.

[1], [4], [5], [6]

Alkion kantasolujen lähteet

Tänään lähteitä alkion kantasolujen laboratoriotestejä Line hiiren teratokarsinooman (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) ja ihmisen teratokarsinoomasta (NTERA-2, Tera-2- , H-9 klooni), sekä Hess Trauneona. Kuitenkin, kun läsnä yksityiskohtaisesti solun passi ilmaisee immuunijärjestelmän fenotyypin, kromosomi analyysitulokset mRNA: n ekspression profiileja alttiina reseptoreihin ja proteiinin solunsisäinen signalointi ei kompensoi merkittäviä haittoja teratokartsinomnyh linjat ESC - nopea menetys totipotenssi ja mahdottomuus sovellus kliinisissä tutkimuksissa, ja sekoitetaan erilaistumista viljelmässä on erittäin vaikeaa eristää puhdasta erikoislinjaa heterogeenisesta solujen joukosta. Näin ollen, yleensä lähde TSK linjat tuotettu kliinisiin tarkoituksiin, toimii sisäsolumassasta blastokystin, alkioiden yksittäisen blastomeerejä 8-solun kehitysvaiheessa, solujen morula myöhemmässä vaiheessa, ja ensisijainen sukusolujen.

On huomattava, että teratokarsinoomasoluilla, vaikka niillä on pluripotenssin ominaisuus, on merkittävästi alhaisempi pluripotenttipotentiaali verrattuna ESC: hen. Niiden integraatio alkiosolujen kanssa johtaa harvoin kimeeroiden muodostumiseen, joissa ei myöskään muodosteta sukusoluja, joilla on teratokarsinoomasolujen genotyyppi. Uskotaan, että tämä johtuu kromosomipoikkeavuuksien usein esiintymisestä teratokarsiinisolujen viljelyssä: Y-kromosomin menetyksen, erilaisia trisomia, deleetioita tai translokaatioita.

Yrittää erottaa ihmisen ESC-linja on suoritettu monta kertaa, mutta tätä tehtävää ei voitu ratkaista, koska normaaleja ihmisen blastoyyttejä on vaikea päästä esineisiin. Lisäksi ihmisissä kromosomipoikkeavuuksien esiintymistiheys on korkeampi kuin eläinten alkion muodostumisessa. Vallitseva enemmistö in vitro -hedelmöityksen jälkeen saaduista varhaisista ihmisalkioista on kaoottinen kromosomaalinen mosaiikkisuus ja usein esiintyy numeerisia ja rakenteellisia poikkeavuuksia. Vieläkin myöhemmin, blastofyysivaiheessa vain 20-25% ihmisalkioista koostuu soluista, joilla on normaali kariotyyppi. Tällaisia alkioita oli lähes mahdotonta luoda TSK, koska zygoteja viljeltiin yleensä kahden tai neljän blastomeerin vaiheisiin ja siirrettiin sitten kohtuun. Vain suhteellisen viime aikoina oli luotettava tekniikka, joka on kehitetty lannoitetun ihmisen munasolujen viljelyyn blastofyysivaiheeseen. Tämän tekniikan käyttöönotto in vitro -hedelmöityksessä paitsi kasvatti onnistuneen implantaatiotuloksen taajuutta, mutta myös tehnyt normaaleja blastoyyttejä entistä helpommin käsiteltäväksi kohteeksi.

Toinen pluripotenttien kantasolujen lähde on ensisijainen seksi soluja, jotka, toisin kuin kehittyneemmät kantaisä populaatiot germenativnogo epiteelin, eivät ole pinnalla beeta-integriini, mutta näihin suuri aktiivisuus shelochnoy fosfataasilla. On huomattava, että kokeessa kantasolujen väestöä, joka muodostettiin primäärisolutoluista, on tutkittu viime vuosisadan 80-luvulta lähtien. Samanaikaisesti kehitettiin tekniikka primääristen itysolujen eristämiseksi hiiren alkion gonadin rudimentista. Ensimmäinen epäonnistunut tulokset viljelemällä alkuitusolujen in vitro viittaa turhuuden näitä pyrkimyksiä, kuten solujen käyttöön, vaikka selvisi, mutta eivät lisäänny ja kuoli ensimmäisen päivän. Myöhemmin havaittiin, että ensisijainen hiiren sukusolujen lisääntyä in vitro, kun läsnä on vain viljelyalustassa liukoisen ja membraaniin sitoutunut spesifinen polypeptidi kasvutekijöitä. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että on välttämätöntä, että läsnä viljelyväliaineessa ei vain LIF, mutta membrannosvyazannyh ja Steel-liukoisen tekijän (SIF) selviytymisen ja proliferaation alkuitusolujen. Näitä peptidejä tuottaa somaattiset solut, jotka ovat homotsygoottisia Teräksen mutaatiolle, ja yksi niistä on proto-onkogeenin cKit-ligandi.

Nisäkkäiden ja ihmisten primääriset itysolut ovat ekstragonadal-alkuperää ja ovat sukupuolisolulinjan kloonaalisen kehityksen lähde. Lähtöviivalla Alkuitusolut, sekä kaikki kudokset alkion ja extraembryonic mesodermiä antaa epiblast (ensisijainen Ektodermi) varhaisten alkioiden ottaa mosaiikki organisaatiorakenteesta. Varhaisen alkion eri osien mikrokirurginen poisto muodos- taa lokalisointivyöhykkeen primääristen itysolujen sitoutuneiden esiasteiden kloonin epiblastien. Kanssa rodamindekstrana joka käytettiin solumarkkerille se havaittiin, että lähtöaineiden alkuitusoluiksi sijaitsee proksimaalisen alueen epiblast, lähellä extraembryonic Ektodermi. Ensisijainen seksuaalinen solulinja ilmenee 45-solukudosta, jonka jakautuminen tapahtuu mahalaukun alussa. Sitten tapahtuu kloonisegregaatio, ja gastrulaation aikana primääriset sukupuoli-solut tulevat extraembryoniseen mesodermiin ja ne löytyvät allantois-alun pohjasta primäärisen nauhan takana. Tästä lähtien primaarisolutolut siirtyvät Endocervix endodermin ventralaaliseen päähän ja siirtyvät sitten aktiivisesti mesenteryä pitkin, jolloin genitaalirullien populaatiot siirtyvät maahanmuuton lopussa. Siirtymisprosessissa, samoin kuin ensimmäisten 2-3 päivän lokalisoinnin aikana gonadin rudimentissa, primääriset seksuaaliset solut aktiivisesti lisääntyvät ja niille suoritetaan kahdeksan toistuvia syklejä. Jos maahanmuuton alkaessa on noin 50 primääristä sukusolua, sen jälkeen kaksitoista päivän kehityshäiriöiden hiiren alkioiden lisääntymiskystareissa primääristen sukupuolisolujen lukumäärä ylittää 25 000.

Toiminnallinen samankaltaisuus sosiaalineuvostojen ja alkuitusolujen osoittaa täydellinen integrointi jälkimmäinen vaihtoehto blastokystin sisäsolumassasta ja sen jälkeen koko alkion, kudos, joka koostuu ainoastaan jälkeläisiä alkuitusolujen. Mukaan muut ominaisuudet hiiren ensisijainen sukusolujen PGC: t olivat myös identtisiä, joka osoittaa kyky erilaistua eri suuntiin, muodostaen embryonaaliset rykelmät in vitro, joka on in vivo muodossa teratomat kun niitä injektoidaan ihon alle immuunijärjestelmän omaaviin hiiriin muistuttava spontaani teratomat kives hiirten linja 129 / ter.

On osoitettu, että, kun se lisätään LIF väliaineeseen, ja liukoinen membrannosvyazannogo SIF eristetty ensisijainen sukusolujen 8 päivän hiiren alkioiden hengissä ja lisääntyä viljelmässä 4 päivä, mutta kuolevat. Lisäksi ajanjakso kun viljelmä kuoleman havaittu alkuitusolujen yhtyy kehitysvaiheessa hiiren alkioiden (12,5-+13,5päivä), kun silmut ensisijainen sukurauhasten naaras sukusolujen syöttää meioosin, ja uros alkuitusolujen estetään mitoottisen jako. Jos kuitenkin lisäät ympäristöstä paitsi kasvutekijät LIF ja SIF, vaan myös FGF2, ensisijainen sukusoluista jatkaa proliferirovat ja alakulttuurien muodostuvat -solupesäkkeitä voi lisääntyä, vaikka se pois ympäristöstä kasvutekijöiden (SIF ja FGF). Tällaisia soluja voidaan kasvattaa pitkään alkion fibroblastisubstraatilla lisäämättä liukoista kasvutekijää LIF. Nämä ovat stabiileja solulinjoja, jotka on johdettu primaarisista sukusoluista, joita ehdotettiin kutsutuiksi alkion sukusoluiksi. Tämä termi ei voida pitää onnistunut kuin viljeltäessä EG-solut eivät voi saada alkion itusolujen, joka kykenee suorittamaan seuraavissa vaiheissa munasolujen muodostumisen eri vaiheisiin tai spermatogeneesin. Tämä johtuu siitä, että EG-solulinjat, vaikka johdettu alkuitusoluiksi, mutta viljelmässä hankkia ominaisuuksien alkion pluripotenttien kantasolujen menettävät kykynsä sitomista germenativnye linja. Toisin sanoen, ensisijainen sukusoluista viljelyn menettää ominaisuuksiaan sukusoluja muuntuu esiasteita ja ESC kaltaisia pluripotenttien.

On huomattava, että kun immunodeficent EG-hiiret annetaan, teratomeja ei esiinny. Oletetaan, että ihmisen EG-solujen kyvyttömyys aloittaa teratomeja johtuu siitä, että näitä rivejä ei syntynyt suoraan viljellyistä primäärisolu-soluista, vaan ne saatiin alkioista eristetyistä soluista. Siksi on mahdollista, että ne ovat pluripotenttisten, mutta jo sitoutuneiden solujen jälkeläisiä.

On huomattava, että EG-solujen ja primäärisolutolujen välillä on perustavanlaatuisia eroja. Jälkimmäiset eivät anna mahdollisuutta saada kimeerisiä hiiren alkioita, mikä osoittaa, että primaaristen sukusolujen kyky ei ole integroitu sisäiseen solumassaan tai tropekodermiin. Ensisijaisten sukupuolisolujen populaation ominaispiirteet ovat samankaltaisempia kuin myöhemmin alkioiden somaattisten solujen sitoutuneet linjat, joiden käyttöönotto blastocystiin ei myöskään johda kimeeristen alkioiden muodostumiseen.

Muuntamalla viljellään embryonaalisia saatu EG-aggregaatiota solujen annettiin valinnan selektiivisellä alustalla vastaanottaa toisen populaation pluripotenttien solujen, joita kutsutaan "soluiksi, jotka ovat peräisin embryonaalisia (embryonaalinen rykelmä peräisin olevat solut - EBD-solut). EBD-solujen kyky moninkertaistaa pitkään viljelmässä, jonka ansiosta voidaan luoda sitoutuneiden solujen stabiileja solulinjoja. Solujen kloonit, jotka ilmentävät mRNA: n laajaa spektriä ja erikoistuneiden solujen proteiini-markkereita. Tämän lähestymistavan seurauksena osoittanut, että ensisijainen seksi ihmisen pluripotenttien solujen, ja erilaistuvat in vitro eri solutyypeissä: neuronit, glia, verisuoniendoteelissä, hematopoieettiset solut, lihas, endodermaalisissa soluja.

Alkion kantasolujen vaihtoehtoiset lähteet

Ihmisen ESC-linjojen vaihtoehtoinen lähde voi olla hybridisoluja. Implantaatiota kohtuun valeraskaana lehmien geterogenomnoy rakenne saadaan, kun yhdistämällä elektroporaatiolla fetusa ihmisen somaattisten solujen kanssa muna lehmät, joka oli aiemmin poistettu esitumaan, tekee mahdolliseksi saada sisäkennon massa ennen implantaatiota alkion keinotekoinen kehitysvaiheet. Tätä tarkoitusta varten, ensimmäisessä vaiheessa saadaan blastokystiin muna lehmä siirretyn ihmisen solujen tumaan.

Toisessa vaiheessa alkioblaasi uutetaan blastoyytistä ja siitä - Thomson-menetelmän mukainen ESC. On huomionarvoista, että parhaat tulokset erottaminen TSK linjat tällä menetelmällä saatiin käyttäen ytimien follikkelien solujen tai alkuitusoluja että jatkuvat ihmiskehossa tilassa lepotilaan. Tämä johtuu siitä, että lehmän muna siirrettyjen ihmisen soluja tuma neukorochennye pitäisi olla korkea aktiivisuus ja telomeerivasta telomeazy joka välttää ennenaikainen vanheneminen TSK klooneja johdettu hybridi muna (Repin, 2001). On tunnettua, että tärkeimmät solunsisäiset markkeri-EGF-proteiinit ovat Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, jotka kuuluvat niin kutsuttuihin kromatiinin vaimenninproteiineihin. Äänenvaimentimet tarjoavat erityisen kompakti heterochromatiinin pakkaus, joka estää eukromatiinin silmukoiden muodostumisen. Näiden proteiinien välittämien kromatiinipaketti korreloi ESC-genomin totipotenssin kanssa. Tähän mennessä on todettu, että kypsät ovilavat naudat ja ihmiset ovat ainoa erityisoluista tyyppiä, jotka sisältävät suuria pitoisuuksia äänenvaimentimen proteiineja sytoplasmissa. Tällä perusteella kehitettiin menetelmä hybridi-ESC-yhdisteiden tuottamiseksi siirtämällä somaattisia solusydämiä lehmien ei-ydinvoimaloihin. Alustavat in vitro -tutkimukset osoittivat, että sytoplasmassa varhaismunasolujen lehmien palauttaa totipotenssi genomissa ihmisen somaattisten solujen tumiin kuluttua 12-24 tunnin viljelyn.

Erityisen mielenkiintoisia ovat tiedot ihmisalkioiden preimplantaatiokehityksen ominaisuuksista, jotka osoittavat myöhemmin totipotenttien solujen korvaamisen pluripotenttien solujen populaatiolla kuin hiirillä. Solutransformaatioiden tutkimus osoitti, että ihmisen blastocyytin solunsisäisen solumassan solut tuottavat ESC: n lisäksi myös trofoblastisoluja, jotka ilmaisevat niiden kokonaisvoimakkuuden.

Tiedetään, että blastocyyn vaiheessa on kaksi eri tavalla sitoutuvaa solupopulaatiota. Yksi niistä on blastoyytin, trofectodermin, ulompi kerros, joka on peräisin trofoblastisoluista ja muista alkion istukka-osista. Toinen solujen populaatio ryhmitellään tiheään massaan, joka koskettaa tropekodermin sisäpintaa. Sisäisen solumassan solupopulaatio on peräisin kaikista alkion elinten kudoksista ja bakteereista. Myöhäisen blastocystin vaiheessa muodostuu ylimääräinen embryonaalinen endodermi sisäisestä solumassasta ja muodostuu epiblastia (primäärinen ektoderma). Samanaikaisesti epiblast-solut säilyttävät pluripotentiaalin, kun taas kyky erilaistaa itäperäisen endodermin solut on rajoitettu.

[8], [10], [11], [12], [13], [14], [15]

Ihmisalkion kantasolujen saaminen

Viime aikoihin asti uskottiin, että trofoblasti saadut hESCs mahdotonta. Kuitenkin diploidi line trophectoderm eristetyt kantasolut blastokystistä väliaineessa, joka sisältää, sen sijaan, että LIF ja FGF2: hepariini, lisääntyy ja muuttuu kantasoluja. Jos poistat keskuudestasi FGF2, The trophectoderm solut lopettaa jalostukseen, he alkavat endoreduplikaatio kromosomien ja soluelementeistä trofektodermalnye vähitellen jättiläinen trofoblastisolujen. Luultavasti, LIF ei stimuloida trophectoderm solujen johtuu siitä, että FGF2 laukaisee mekanismi transsignalizatsii kuin FGF2, sitoutuminen sytoplasminen reseptoriin (FGFR2), aktivoi MAP-kinaasin sytoplasmassa - ERK1 ja ERK2. Näin ollen, kun soluihin sisältynyt blastokystin yhden signalointireitin (LIF - gpl30 - JAK-kinaasi - STAT3) sisäsolumassasta transformoidaan pluripotentteihin hESCs, kun taas aktivoimalla toinen mekanismi transmembraanisignaloinnin (FGF2 - FGFR2 - MAP-kinaasien ERK1 / ERK2) kantasolujen alkiorakkula trophectoderm muodostettu. Valinta signalointireitin puolestaan riippuu aktiivisuuden geenin Oct4. Tämä geeni kuuluvat POU domain, joka sijaitsee lokuksen t 17 autosomeiksi ja ilmaistaan aikana munasolujen muodostumisen eri vaiheisiin, murskauksen aikana sekä soluissa sisäsolumassasta blastokystin ja alkuitusolut. Toiminnallista roolia Oct4-geeni, joka koodaa transkriptiotekijää välttämätön esiintyminen pluripotenttien solujen, niiden erilaistumista ja erilaistamattomuus.

Oct4-geenin ilmentyminen ESC: ssä vaihtelee riippuen tämän transkriptiotekijän vuorovaikutuksesta kofaktorien kanssa. Suunnattu ilmentymisen säätely Oct4 blastokystassa osoitti, että sen aktiivisuutta alemmissa puoli muotoja trophectoderm soluja, kun taas korkeammilla indusoima Oct4 syntyy pääasiassa hESCs.

Kokeessa TSK voi kääntää linjaan viljelemällä totipotentit blastomeerejä pilkkominen vaiheessa ja siinä vaiheessa gastrulaation ja myöhemmissä alkionkehityksen. Hiiri sosiaalineuvostojen tavallisesti annettava +3,5-+4,5päivä raskausviikolla, mikä vastaa kuudennen (yksikerroksinen blastokystin) ja seitsemännen vaiheen (kaksi-kerros blastokystin - varhainen muna sylinteri) normaali alkionkehityksen. On ilmeistä, että vain esi- implantaatiokaudella hiirien alkioita sisältävät solupopulaatiot, jotka voidaan muuntaa ESC: ksi. Näin ollen ESC-linjojen eristäminen on mahdollista vain tietyissä alkion alkamisvaiheissa. Totitipotentti, mahdollisuuden kehittää elinkelpoinen alkio alkiomembraanien ja istukan kanssa, ovat zygootti ja blastomeerit, jotka syntyvät murtumisen aikana. Aineksen solujen kokonaistehokkuuden menetys alkaa myöhään morula-vaiheessa, kun taas blastomerien hienonnus riippuu niiden sijainnista. Varhaiset Morula blaetomers säilyttävät totipotency, koska kokeelliset manipulaatiot, joilla on muutoksia sijainnissaan, esimerkiksi niiden sijainnin kääntäminen, eivät estä täydellisen alkion kehittymistä.

Havaittiin, että ESC: n vapautumisella hyötysuhteeseen vaikuttavat blastokystien tila niiden eksplantaation aikana. Käyttö blastokystien jälkeen seitsemän päivän simulointi diapaussi sukuelinten hiirten, joilta oli poistettu munasarjat on 3,5 päivä raskausviikolla ja käsiteltiin progesteroni, edistää enemmän onnistunut erottaminen linjat alkion kantasoluja. Oletetaan, että tällaisissa olosuhteissa sisäisen solumassan muodostavien blastomeerien määrä kasvaa. On myös mahdollista, että solusykli jatkuu ja useimmat blastomeerit tulevat G0-vaiheeseen.

Lisäksi luominen vakaa pluripotenttien hESC linjat riippuu genotyyppi alkioiden: melko helposti erottaa sosiaalineuvostojen hiiren blastokysteihin linja 129, on huomattavasti vaikeampi saada niitä käyttämällä hiirissä CS7BL / 6 ja käytännöllisesti katsoen mahdotonta eristää linjan hESCs blastokysteihin CBA / Ca-hiirissä. Ilmeisesti varhaisilla alkioilla on joitakin geneettisiä piirteitä, jotka vaikuttavat pluripotentin ESC-linjan kehittymiseen. Kuitenkin, kun niitä viljellään epiblast eristetty, sekä selektiivinen valinta erottaa hESCs solulinja varhaisten alkioiden CBA / Ca-hiiriä vielä varattu.

Todistettu standarditekniikka ESC-linjojen hankkimiseksi blastoyytteistä on annettu laboratoriokäsikirjoissa alkion alkioiden kokeilumenetelmällä. Kokeellinen Hess voidaan saada viljelemällä eristetty epiblast (ensisijainen ectoderm) 4,5 päivän ikäisissä hiiren alkioissa, käyttäen mikrokirurgisia tekniikoita melko monimutkaisia ja modifioitu viljelyolosuhteissa. Tämän menettelyn monimutkaisuus on perusteltu, koska ESC-linjojen muodostumisnopeus oli paljon suurempi kuin käyttäminen blastoyytin sisäisen solumassan kanssa.

ESC-linjojen eristämiseksi kukin klooni siirretään mikrokuopaan, kasvatetaan 40-60 solujen aggregaattia, se taas hajoaa. Useita toistoja tämän menettelyn avulla saavutetaan kuolemattomiksi ESK mukaisesti suurin proliferaationopeuden normokariotipnyh kiinnittyneiden solujen muovi, joka kanavien läpi 50-100 säilyttää totipotenssi ja korkea telomeraasiaktiivisuus. Prosessissa tukevien linjojen ESC suurin vaara on pilaantumista tai seerumi bakteeriendotoksiineilla - jopa jälkiä Endotoksiinipitoisuudeksi viljelyalustassa aiheutti massa kuoleman kypsymättömiä sukusoluilla. Huolellisella valvonta lineaarinen kasvu ja ajoissa dispersio sosiaalineuvostojen viljelmässä pystyvät symmetrinen ydinfission, jossa molemmat tytärsolut jäävät pluripotenttien ja pystyy suorittamaan rajattoman määrän solusykleihin, säilyttäen diploidi karyotyyppi ja koko teho.

Ihmisen ESC-yhdisteiden puhtaan populaation valinta voidaan suorittaa transfektoimalla niiden rekombinantti-DNA-molekyylien genomiin, joka sisältää geeniä, joka koodaa vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP). GFP-proteiinin ekspressio lisääntyy kasvaa sosiaalineuvostojen ympäristössä tukemaan niiden lisääntymistä, kun taas alussa erilaistumisen geenin ilmentymisen taso on vähentynyt, joka mahdollistaa valittu selektiivisellä alustalla puhdas vakaa, pluripotenttien solulinjojen. Kun kasvatetaan GFP: n valikoimalla ESC-yhdisteitä, pesäkkeiden taajuus kasvaa suuresti, koska valikointikasvien olosuhteissa erotettujen solujen voimakas antiproliferatiivinen vaikutus eliminoituu.

Käännös ihmisalkion kantasolujen rivi avulla niiden eristämisessä käytetty menetelmä preimplantaation alkioiden (vaihe 80-120-solut), jotka jäävät jälkeen in vitro hedelmöitys menettelyssä. Tehdä tämän synteettisesti tuotettu "ylimäärä" alkioiden dispergoitiin mekaanisesti keskipitkällä Delbekko neula. Sen jälkeen kun solut on merkitty selektiivisillä monoklonaalisilla vasta-aineilla fluoresoivalla leimalla, solujen embryoblasti solut eristetään. Alkioblasti hajotetaan yksittäisiin soluihin käyttäen disaspasi-kollagenaasin seosta. Dissosioidut soluja kasvatettiin erityisen väliaineessa (80% Delbekko väliaine + 20% vasikan sikiön seerumia, kun läsnä on 500 ug / ml IL-6, LIF ja SCF) on yksikerroksista alkion fibroblastien feeder 3 ensimmäinen kohtia. Näin selviytymistä ja proliferaatiota kanta- ja progenitorisolujen ylläpidetään altistuminen IL-6, LIF ja SCF. Tässä ympäristössä, suspensio hESCs kasvaa kloonien osharennyh irrallinen solujen voida erottaa varovasti useita pipetoimalla. Kiinnostuneessa kulttuurissa ilmestyvät uudet kloonit 5.-7. ESC: n suurin kasvuvauhti saavutetaan kloonien toistuvalla dissosiaatiolla 10-15 solujen vaiheessa. Sitten jokainen klooni siirretään mikro-soluun ja kasvatetaan 40-50 solujen aggregaattiin. Menettely toistetaan monta kertaa kulkuväylissä lisäämällä viljelmän tilavuutta tiheyteen 5-10 miljoonaa solua kuusikymmentä senttiä kohti. Käyttämällä tällaista Thomson viemällä se eristettiin 10 kloonia kuolematon ihmisen sosiaalineuvostojen joka kanavien läpi 100 säilyttää korkea telomeraasiaktiivisuuden, kyky voimakas lisääntymistä ja fenotyyppisten ominaisuuksien vähintään yhteensä teho, erilaistumisen jossakin 350 erikoistunut solulinjat, jotka ovat peräisin ecto-, meso- - ja endoderma. Erilaistumista ihmisen ESC alkoi (vaihtamalla väliaine, lisäämällä ja poistamalla seerumi LIF) solujen kiinnityksen alustaan, mikä osoittaa kehitys solun tukirangan ja adheesioreseptorien ilmentämisessä. On tärkeää, että ihmisen ESC: iden rajoittamattomalla leviämisellä säilytetään normaali kariotyyppi.

Toinen ihmisen ESC-linjojen eristämismenetelmä perustuu primääristen sukupuolisolujen käyttöön. Kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että Eu-solulinjat voidaan saada 12,5 päivän vanhojen hiirten alkioiden genitaaliplakkeista. Näissä tapauksissa esisolusolulinjojen muodostumisnopeus oli kuitenkin merkittävästi alhaisempi kuin aikaisempien alkioiden kokeissa. Samanaikaisesti 13,5 päivän raskauskauden hiiren alkioiden gonadien primääriset sukupuoli-solut eivät yleensä pysty muodostamaan rivejä.

Ensimmäinen stabiilit linjat ihmisen pluripotenttien EG-solut johdetut gonocytes eristettiin sukupuolielinten primordia 5-9 viikon ikäisten alkioiden. Eristetyt solut viljeltiin alustalle inaktivoitua hiiren alkion fibroblasteja DMEM-elatusaineessa, jossa sikiön seerumia, johon lisättiin merkaptoetanolia, forskoliinia, samoin kuin rekombinantti ihmisen kasvutekijöiden (FGF ja LIF). 7-12 päivän kuluttua multisellulaariset pesäkkeet ilmestyi viljelmään morfologisten ominaisuuksien ja molekyylimerkkien mukaan, jotka vastaavat ihmisen EG-soluja. Yhdistymisen jälkeen nämä solut muodostivat alkio-elimiä, joiden kehittyminen johti erikoistuneisiin soluihin, jotka ovat ominaisia kaikkien kolmen alkionlehden johdannaisille. Koko 10-20-osaa pitkin EG-solulinjat säilyttivät normaalin kariotyypin ja eivät menettäneet pluripotenssia.

On myös osoitettu, että LIF: n, membraaniin sitoutuneiden ja liukoisten terästekijöiden sekä TGF-b: n yhteisvaikutus muuttaa primääristen itysolujen kehittämisohjelmaa. Sen sijaan, että pysyttelisivät mitotiset jakautumiset ja alkavat eriytyä oogeneesiin tai spermatogeneesiin, primääriset sukupuolikennot jatkavat lisääntymistään. Useiden mitoottisten syklien jälkeen ne muuttuvat samanlaisiksi kuin epiblastisoluilla ja menettävät sukusolujen esiasteiden ominaisuudet muunnetaan pluripotentteiksi alkionkudoksen EG-soluiksi.

Näin ollen vuonna 1998 ensimmäisten sukupuolisten solujen kuolemattomia viivoja eristettiin ensin ihmisen sikiön autopsiakudoksen seksuaalisesta rudimentista. Sikiönkehityksen Ihmisen ensisijainen sukusoluissa näkyvät ruskuaispussista kolmannella viikolla kehitystä, sekä 4-5th viikkoina, nämä solut kulkeutuvat seksuaali- tuberkkeli, jossa ne muodostavat väestöstä ensisijainen dormantnye gonocytes. Inaktiivisessa tilassa primäärisolutolut pysyvät alussa syntymässä. Itusolujen primääriset linjat uutettiin sikiön genitaalikyhmy 5-9 viikon ikäisten alkioiden haetaan ex tempore kangasta, joka on käsitelty seoksella, jossa oli tyypin IV kollagenaasia-V, hyaluronidaasin ja DNaasia määrällisiä ja laadullisia lisäys solujen saanto. Ensisijainen sukusolujen kudoksessa sikiön genitaalikyhmy ympäröivät strooman (mesenkymaaliset) Sertoli-solut. Toiminnallinen tarkoitus Sertoli-solujen on tuotanto anti-apoptoottisten tekijöiden (Fas-ligandi), mitogeenien, ja immunosuppressiiviset aineet, jotka suojaavat seksuaalinen kantasolujen immuunihyökkäystä elimistöön. Lisäksi suolen tuberkuloosin stromal mikroympäristöllä on tärkeä rooli sukupuolten kypsyessä. Eristetyt primäärisolutolut istutetaan viljelmään syöttöstromalokerroksen päälle, joka koostuu ensimmäisten kolmen peräkkäisen solun sikiön fibroblasteista. Tehokkain yhdistelmä mitogeenien on tunnustettu monimutkainen koostuu LIF, FGF ja forskoliinia (cAMP: n muodostumisen stimulantti). Leviämisen Alkuitusolut in vitro tarvitse lisätä sikiön seerumia, läsnä ollessa ensisijainen lisääntymisen gonocytes viljelmässä kloonien mukana muodostumista pallomaisia, ei-tarttuvat solut substraattiin.

Yhdysvaltain National Institutes of Health pohjalta yhteenvedon olemassa olevia tietoja jakomenetelmiä ihmisen ESC linjat blastokystiä tehtiin alustava päätelmä, että onnistunut jakaminen TSK todennäköisin viljeltynä blastokystiä hyvin muodostuneita sisäsolumassasta (Kantasolut: tieteen kehitykseen ja tulevaisuuden tutkimuksen suuntiin Nat. Inst, Health USA). Tästä näkökulmasta paras lähde sosiaalineuvostojen luoda linjat ovat ihmisen alkiorakkulaan 5. Päivä kehitystä, josta jakamisesta sisäsolumassasta tulee varovasti trophectoderm. Eristetty sisäsolumassasta, joka koostuu tässä vaiheessa 30-35 solut on viljelty alustalle hiiren sikiön fibroblasteja, joka on ratkaiseva edellytys muodostumista pesäkkeiden viljelmässä hESCs.

Alkion kantasolujen fenotyyppisten ominaisuuksien analysointi

Erityisen mielenkiintoinen on ESC: n fenotyyppisten piirteiden interspesifinen vertaileva analyysi. Havaittiin, että ihmisen ESC siirtomaita - tiheä klustereita litistetty epiteelin soluja, kun taas hiiret embryoid vasikka koostuvat löysä ryhmittymässä pyöristetty soluja. Ihmisen ESC: ssä ydin-plasmasuhteen indeksi on pienempi kuin hiiren ESK: ssa. Apinoiden empiiriset kantasolut muodostavat tasaisempia solupesäkkeitä, joilla on epätasaiset reunat. ESC-kädellisten varhaisissa klooneissa nähdään helposti yksittäisiä soluja. Lisääntyvissä hESCs kaikki eläinlajit eivät ilmennä MHC-luokan I ja II. Samaan aikaan, ihmisen sosiaalineuvostojen antaa myönteisen vastauksen vasta TERA 1-60 ja GCTM-2, joka osoittaa, että läsnä pinnallaan keratiini / kondroitiinisulfaattiproteoglykaaneja ominaisuus alkion (teratoomat) -kartsinomnyh kantasoluja. Ilmentyminen hESCs kaikenlaisia eläimiä Oct4 geenin viittaa siihen, että, vaikka fenotyyppiset erot ihmisen ja hiiren sosiaalineuvostojen, ilmeisesti aktivoidaan samojen geenien ylläpidosta pluripotenttisuuden (Peru, 2001). Lisäksi TSK linjat, jotka ovat peräisin alkion rotat, siat, kanit, kädelliset, ja karja, on samanlaiset morfologiset ominaisuudet, on vastaava joukon tunnistettu molekyylitasolla markkereita ja lähes identtinen molekyylipaino mekanismin toteuttamiseen alkionkehityksen ohjelma, jonka avulla voit ottaa uusi katsomaan ksenotransplantaatio kyseessä .

Toisin kuin tavalliset embryogenesis in vivo, in vitro proliferaatio hESCs mukana ei ole muodostumista itukerroksessa ja etenee lohkoon homeotic Nohgenov tausta, eli ilman organogeneesin. Koska segmentointi geenit eivät toimi viljelmässä hESCs mahdotonta toistaa tällaisia jaksoja alkionkehityksen kuin välilehden somiitti tuman segmentoituminen, muodostumista ruskuaispussin, allantoiskalvoon väliaikaisluonteinen ja muihin elimiin ja kudoksiin. Kulttuuri-ESC: t jäädytettiin 350 erikoistuneiden solujen rajoituslinjojen muodostumisen alussa. Siten, klooni tytäryhtiö progenitorisolujen ja keskitetysti lokalisoitu PGC: t ovat vain malli alkion kehityksen aikana, jossa eri kudosalueille muodostetaan yhdessä vaiheessa ovat erilaisia erikoistuneita soluja peräisin, kuitenkin, yhteiset lähtöaineet. Vaikka vähimmäistason reseptorien pinnalla hESCs, ne säilyttävät kyvyn suorittaa primitiivinen solunjakautumisessa simuloidaan pääosa varhaisen alkion rakenne: lietteen hESCs viljelmässä ja aggregaattien muodostaa rakenne muistuttaa blastokystin tai jopa myöhemmin alkiot (muna sylinterit). Tällaisia suspensioaggregaatteja nimettiin tarkoituksenmukaisesti yksinkertaisiksi ja monimutkaisiksi alkio-elimiksi.

Kun sekoitettu erilaistua eri soluille embryonaalinen rykelmä ekspressoi samanaikaisesti varhaisten geenien ektodermistä (Oct3, FGF-5, solmukohtien), endodermistä (gata-4), mesodermi (brachyury), sydänperäinen mesodermi (PKH-2,5), hermostoputken (msx3 ) ja hematopoieesi (elkf). Käyttäen erilaisia yhdistelmiä sytokiinien ja kasvutekijöiden kohdentamiseksi muodostumista sukusolujen kerroksen solujen in vitro useissa tapauksissa oli mahdollista saada embryonaalisia, jotka edullisesti ilmentyvien geenien ektodermistä tai mesodermin, joka avaa tien mallintamiseen gastrulaation ja varhaisen organogeneesin aikana.

Klonaalista kasvua hESCs on todisteita epäsymmetrinen solunjakautumisen Yhden TSK keskellä klooni säilyttää ei-rajoittavia lisääntymiskykyyn, kun taas muut tytärsolu aiheuttaa sukupolven progenitorisolujen erilaistumista on jo tulossa. Näin ollen, klooni etenemisnopeus kehällä embryonaalinen rykelmä on suurempi kuin keskellä. Raja-solut kasvavat klooni tapahdu spontaania erilaistumista epäjärjestykseen vaeltavat tai kuolla apoptoosin mekanismeja. Nämä tapahtumat päättää kohtalosta kloonin jos leviämisen ylittäessä siirtymisen määrää ja apoptoottisen solukuoleman, klooni koot lisääntyvät edelleen, stabilointi tapahtuu yhtä apoptoosin ja määrä muodostuu uusia solun nopeus, regressio - käänteinen suhde näiden prosessien. Progenitorisolujen jakaa symmetrisesti, eli molemmat tytärsolut myöhemmin erilaistua kypsiksi erikoistunutta solulinjoihin. Suhde TSK / progenitorisolujen vaihtelee, mutta on aina määrä PSCs on vain murto-osa yhden prosenttia väestöstä progenitorisolujen. Siksi vain perusteellisesti ja ajoissa pipetointiin erittelemään kloonit voivat lisätä määrää sosiaalineuvostojen kulttuuriin. Erottelun klooneja ilmestyi vaiheessa 10-12 soluissa tehokkain saada enimmäistuotosta hESCs. Solujen eriytymisen suunta ja astetta alkion ruumiissa riippuu niiden sijainnista. Ulkopuoli embryonaalinen rykelmä solut eivät ekspressoi geeniä ja Oct4 jotka erilaistuvat ensisijainen Endodermi soluissa, joista sitten muodostetaan Epithelioid solujen ja päälaen extraembryonic sisäelinten Endodermi. Sisäinen embryonaalinen rykelmä solut ilmentävät Oct4 säilyttää pluripotenssia geenin ja 48 tunnin viljelyn jälkeen. Mutta sitten morfologiset uudelleenjärjestely tapahtuu epiteelin yksikerrosviljelmässä alkaa ja geenien ekspressiota, jotka ohjaavat kehitystä ensisijainen ectoderm. Sitten alkaa kaiken hajotetun sytodi-diversifioinnin prosessi erilaisten solutyyppien ulkonäönä, jotka ovat kaikkien kolmen entsykaalisen levyn johdannaisia. Prosessissa spontaanin erilaistumisen embryonaalinen rykelmä solut ensin syntyy aggregaatteja endodermillä markkereita sisältävien fragmenttien (kystat) ruskuaispussin. Lisäksi näissä rakenteissa esiintyy kasvavien kapillaarien angioblasteita ja endoteelisoluja. Loppuvaiheessa spontaanin erilaistumisen sisäisen solujen embryonaalinen rykelmä kehittää erilaisia terminaalisesti erilaistuneita soluja, kuten neuroneja, glia-elementit, kardiomyosyyttien, makrofagit ja erytrosyytit. Tietyissä approksimaatio (ottaen huomioon avaruudellinen inversio muodostavat levyt alkion kudosta) kautta embryonaalisia in vitro voidaan tutkia solunjakautumisessa ja analysoida molekyylitason mekanismeja alkion erilaistumaan alkuvaiheessa, ja vahvistaa rooli tiettyjen geenien täytäntöönpanossa näitä prosesseja.

Siten kloonissa ovat solut, joissa löydetään erilaisia geneettisiä kehityshankkeita - ESC: t, varhaiset progenitorit ja eriytyvät esiasteiden populaatiot. ESC: n viljely menetettävänä pudotuksena tai massakulttuurina ilman syöttökerrosta ja ilman LIF: n lisäämistä väliaineessa johtaa väistämättä alkio-elinten muodostumiseen. Alkioridikappaleiden ulko- ja sisäkerrosten solujen morfologia on erilainen. Ulkokerros koostuu suurista prosessisoluista. Niiden pinta, joka on ympäristön edessä, on peitetty lukuisilla mikrovilliin. Solujen ulkoinen kerros erotetaan Reichert-kalvosta muistuttavasta sisäisestä perusmembraanista, kun taas alkio-elinten sisäkerroksen solut ovat sylinterimäinen epiteeli. Morfologisesti sisäkerros, vaikka se sisältää monia jakautuvia soluja, muistuttaa mieluummin erottelemattomia ESC-pesäkkeitä.

Ihmisalkion kantasolujen ominaisuudet

Koska parenkymaalisten-mesenkymaalisten vuorovaikutuksiin tausta signaali estää geenien homeosis aiheuttaa epäjärjestyksessä kasvua PGC: iden viljelmässä, koska liuska on rikki ja muodostumista infrastruktuurin väliaikaisluonteinen elimiä. Järjestäytymätön kasvua ja häiriökäyttäytymistä spontaanin erilaistumisen hESCs kulttuurin puutteen vuoksi mesenkymaalisten merkinnän strooman tulevissa elimissä: in vitro on mahdollista muodostumista miljoonien maksasoluissa, mutta et voi saada mitään segmenttejä maksan, mukaan lukien rakenteellisten ja toiminnallisten osien, kuten poskionteloiden tilaa Disse ja kupfferinsoluista.

Uskotaan, että pluripotenttisuuden sosiaalineuvostojen toteuttaa yksinomaan alkionkehityksen muodostamiseksi kudosten ja elinten alkion, kun napanuora ja istukka ovat peräisin trofoblasti. Suljettu kuori trofektodermalnuyu ESK johdonmukaisesti tuottaa solukloonien väliaikaisluonteinen toteuttamiseksi kehittämisen ohjelma kombinatorisella mRNA: n suurin Nohteyaov topografisia matriisi, joka ennalta tilajärjestely, muoto, mitat, lukumäärä väliaikaisten ja lopullisten elinten solujen ja parenkyymin kokoonpano rakenteellinen ja toiminnallinen yksikkö. Samalla TSK ovat vain solutyypistä, jossa molekyylimekanismi toteuttaminen niiden mahdollisuuksien täysin erillään geneettisen ohjelman kehittämistä ja ESCO itse riistää mahdollisuus vuorovaikutusta muiden solujen kanssa, koska tukkeutumisen sekä reseptorin käsityksiä ja transsignalizatsii järjestelmiä. Kuitenkin, riittävä aktivaatio sosiaalineuvostojen johtaa asteittain käyttöön alkionkehityksen ohjelma päättyy syntymän on täysin muodostettu ja valmis extrauterine elämän organismin koostuu miljardeja soluja. Näin lyhyessä ajassa, mutta käsittämättömän velan solun tilaan syötön väistämätön esiintyminen virheitä molekulaarisia mekanismeja, jotka tarjoavat solujen elintoimintoihin, ja ohjelmat, jotka ohjaavat niiden proliferaatiota, erilaistumista ja erikoistumista. Näin ollen, moderni farmakogenomiikkaa pitää erikseen tauti Molecular Devices, ja tauti solun ohjelmointi. Ja toiminnan suurin uusia lääkkeitä, joilla pyritään korjaamaan ohjelman nimi eriyttäminen, leviämisen ja organogeneesissä, sekä uudistumista elinten ja kudosten. Aikuisen organismin kautta sosiaalineuvostojen on mahdollista kontrolloida kantasolujen / progenitorisolujen istutetaan aivoihin, maksaan, pernaan, luuytimeen ja muihin elimiin ihmisen korjata vaurioitunut vastaanottaja parenkymaalista elimiä vuoksi erilaistumista ja erikoistuminen luovuttajan mesenkymaaliset solut säilynyt matriisi. Pohjimmiltaan totipotenssi ohjelma käynnistää toisen varhaismunasolun genomitason, zygotes ja blastomeerejä, mutta nämä solut eivät ole vielä mahdollista kloonata ja siirtyneiden määrien tarvittavat tarpeisiin kokemuksellisen ja käytännön lääketieteessä. Näin ollen, TSK on ainutlaatuinen lähde geneettisen informaation, joka sisältää kolmiulotteisen lineaarinen restriktiokartta alkion ja koodit erikoistunut solulinjojen aikana gastrulaation.

Lähes rajattomat mahdollisuudet regeneratiivisen TSK johtuu siitä, että niiden genomissa, toisin kuin geneettinen laite erilaistuneiden somaattisten solujen, ylläpitää pluripotenttisuuden. Yksi osoitus lepotilan juuret sosiaalineuvostojen geneettinen informaatio on niin sanottu vähintään fenotyyppi - pinnalla TSK ilmentämään rajoitettu määrä reseptoreita, ja siksi käyttöön erittäin muutamia ohjelmia vuorovaikutuksessa transsignalizatsii ydin- laite solun kanssa sen mikroympäristöstä. Taustaa vasten lepotilan vastaavien geenien rajoituksia erikoistunut solulinjojen ja solujen erilaistumista, aktivoituu vain noin 30 500 geenejä, joiden tuotteet tarjoavat viestintä solujen kanssa ympäröivän mikroympäristön. Menetelmää käyttämällä sarja-analyysiä geenin ilmentymisen osoittaneet, että yleisyyttä Main funktionaalinen genomi laatikot säätövoiman ja aineenvaihduntaa somaattisissa soluissa ja talous- ja sosiaalineuvostojen viimeksi määritelty erittäin pieni määrä mRNA reseptorien, G-proteiinit, toisiolähettejä, transkriptaaseis-, kofaktorit ilmaisu ja tukahduttaminen että on, koko järjestelmä transmembraanisen säätelysignaalin soluun. Tämä johtuu siitä, ettei tai hyvin heikkoa ilmentymistä geenien transsignalizatsii. Erilaistumisen aikana indusoi genomissa TSK 18 toiminta on pysäytetty synkronisesti toimivat geenit tausta aktivoinnin transsignalizatsii 61-geenin synteesin säätelyssä on soluadheesioreseptoreiden, soluväliaineen komponentit, rajoitus transkriptaaseis- messendzhernyh elementtejä ja signaalin lähetyksen järjestelmä ydin- yksikön plasman solukalvon reseptorit. Samanaikaisesti estetty geenien ilmentymistä vastuussa proteiinien synteesiin äänenvaimentimet sekä geenin ilmentymisen koingibitorov tarjoaa totipotenssi genomin hESCs.

Geneettisiä markkereita löydettiin kaikkien kolmen alkionäytteen soluille. Tunnistaminen ektodermaalinen solukerros kuljetetaan geenien ilmentymistä solmukohtien, Oct3 ja FGF-5, mesodermaalisten solut - geeni brachyury, zeta-globiini, endodermistä - at gata-4-geenin ilmentymistä. Normaalissa alkionkehityksen aikana gastrulaation havaittu aktiivisen migraation epäkypsä väestön kantasolujen ja progenitorisolujen, paikallisesti nimetään alueet kasvojen luut kallo, osa aivojen, ääreishermoston, sydämen johtuminen järjestelmän ja kateenkorvan kudos, joka on muodostettu kloonien joutuneiden solujen. Solujen merkintöjä varhaisia geenejä alkio kerrokset helpottaa topografiset analyysi migraation kantasolujen kehittyvässä alkiossa. On havaittu erityisesti, että solut aggregaattien embryocarcinoma P19 ilmentymisen ensimmäisen geenin mesodermistä brachyury alkaa pelkistyksen aikana geenin ilmentymisen kudoksen plasminogeeniaktivaattorin, a-fetoproteiini, keratiini 8, ja keratiini 19, jotka ovat markkereita varhaisen Mesodermi vaeltavien populaatioissa. Näin ollen kudosten muodostumista mesodermaalisten alkuperää alkaa vasta sen jälkeen, kun vaeltamisprosessia ja laskeutumista kohta mesodermaalisten progenitorisolujen.

Erittäin rajallinen fenotyyppiset ominaisuudet ja se, ettei suurin osa lohkojen transsignalizatsii TSK kuitenkin ilmaista joitakin reseptorimolekyylejä, joita voidaan käyttää tunnistamaan niitä. On huomionarvoista, että antigeenit ovat markkereita ESC ihmisillä ja kädellisillä olivat yleisiä. Useimmiten käytetään merkintöjä hESCs leimattuja vasta-aineita antigeeneille membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (ainutlaatuinen rasva-antigeenit edustavat monimutkainen glykolipidi GL7 siaalihapon), sekä suuri polymeeri glykoproteiinien TRA-1-81, TRA-1-60. Lisäksi hESCs ekspressoivat spesifisiä alkioantigeeni SSEA-1 ja endogeeninen alkalinen fosfataasi, sekä erityinen transkriptiotekijän Oct4. Jälkimmäinen on tarpeen ylläpitää hESCs proliferaatiomekanismeja - erityiset transkriptiotekijän Oct4 geeni aktivoi ekspressiota fibroblastikasvutekijä 4-geenin ekspressiota ja stabiloi boxing vastuussa ei-rajoittavia DNA reduplikaation epäkypsissä soluissa. Tärkein solunsisäinen markkeriproteiinien ovat Oct3, Oct4, Tcf ja Groucho, jotka liittyvät proteiineihin, kromatiinin-äänenvaimentimia.

Lähes välittömästi sen jälkeen, kun pitkän aikavälin viljeltiin sosiaalineuvostojen yritykset on epäonnistunut ja organismi valmistettiin ensin viljelmän kantasolujen eristetty hiiren blastokysteihin, ja ensisijainen sukusolujen soluviljelmässä, alkoi vaiheessa TSK pluripotenttisuuden kapasiteetti tutkimukset, kun sitä annetaan alkuvaiheessa alkion kehityksen. On osoitettu, että morula ja blastokystin PGC: t kykenevät muodostamaan kimeerinen alkioita, jossa luovuttaja-PGC: itä jälkeläiset havaittiin kaikissa somaattisissa kudoksissa ja jopa sukusolut. Siten Developmental Biology ESC komentosarjat "siltana" kokeelliset tutkimukset in vivo ja in vitro, mikä lisäsi merkittävästi mahdollisuutta opiskeluprosesseja Lisää ensisijainen kudosten ja elinten, niiden erilaistumista ja alkion organogeneesin.

Se on vakiintunut, että in vivo alkionkehityksen aikana ESK integroidaan solumassaa varhaisen alkion, ja niiden johdannaisia esiintyy kaikissa elimissä ja kudoksissa. ESC: t kolonisoivat kimeeriseen alkioon sukupuolikennoja, joiden jälkeläiset muodostavat täysimittaiset munasolut ja spermat. Alkion kantasolut ovat klonogeenisten - yhden PGC: t luoda geneettisesti identtinen solupesäke molekyylimarkkereilla, joka sisältää Oct4 geenin ilmentymistä ja alkalinen fosfataasi, korkea telomeraasiaktiivisuus, sekä spesifisten alkioantigeenit.

Mekanismien tutkimiseksi alkionkehityksen käyttäen tekniikkaa hESCs kimerisointi morula luomalla biologisen rakenteen, joka sijaitsee ulkokerroksen tetraploideja blastomeerejä vastaanottajan ja luovuttajan PGC: itä annetaan osaksi. Näin, trofoblasti muodostettu jälkeläisistä tetraploidisista blastomeerejä vastaanottaja, joka mahdollistaa istutusta ja istukkaan, ja luovuttajan PGC: itä joka toimii sisäsolumassasta, joka on muodostettu kannattava iturataan ensisijainen elin ja kantaisä sukusolut. Tutkimus TSK arvo on paitsi että, kun manipulointi in vitro niiden genomin säilytetään pluripotenssin, mutta myös se, että säilyttäen kyky osallistua muodostumiseen hESCs alkuitusolujen kimeerisen alkion. On osoitettu, että vain yksi jälkeläinen muuntogeenisten PGC: t asuttaa kaikki ensisijainen ja mikrobeja rainanmuodostusviiran Kimeerinen alkio on saatu yhdistämällä tai yhteisviljelmä solujen 8-alkioon. Kun istutetaan hiirten morula sosiaalineuvostojen transfektoitiin vihreän fluoresoivan proteiinin geeni, fluoresoiva jälkeläisiä solut havaittiin kaikissa tutkituissa kudoksissa kehittyvän alkion (Shimada, 1999). Transplantaatio TSK morulavaiheen voi luoda elinkelpoinen hiiriä, ruumiin, johon kuuluu pelkästään jälkeläisiä lahjoitti ESC, mikä avaa mahdollisuuksia erilaisiin terapeuttinen kloonaus vaihtoehtoja. Nyt tällainen järjestelmällinen lähestymistapaa on sovellettu onnistuneesti selvittää ongelmia kehitysbiologiaan, erityisesti, se voi analysoida geneettisiä mekanismeja inaktivaatio X-kromosomi tai epigeneettisiä epävakaus hESCs. ESC: n transplantaatiota varhaisiin alkioihin käytetään myös biotekniikassa maataloudessa sekä geeniterapiakokeissa.

Muuntogeenisten ESC-yhdisteiden siirtoja käytetään mutanttigeenien kohdesolujen testaamiseen. In vitro viljeltyjä ESC: itä käytetään biotekniikassa knockout-hiirten luomiseksi. Tätä tarkoitusta varten, homologisen rekombinaation poistettava sosiaalineuvostojen tutkimuksesta geenistä (Knockout) ja valikoivaa väliainetta erittävät soluja, joilta puuttuu tämän geenin. Sitten knockout ESC: t ruiskutetaan blastokystiksi tai aggregoituu morulaattien blastomeerien kanssa. Näin saatu kimeerinen varhaisten alkioiden istutetaan vastaanottajanaaraaseen ja vastasyntyneet hiiret valittu yksilöiden sukusoluja, nullizigotnymi tämän geenin. Tämän tekniikan on luotu monia riviä hiirten, joita käytetään yleisesti kokeellisissa biologian ja kokeellista lääkettä. Näissä biologinen mallitutkimuksissa arvoa tiettyjen geenien alkionkehityksen sekä niiden roolia mekanismit sairauksien ja patologisten tilojen ihmisillä. Lisäksi geeniterapian uusia menetelmiä esikliinisessä testausvaiheessa käytetään niputettujen eläinten rivejä. Esimerkiksi, käyttämällä geenin transfektion ESK normaali alleeli mutanttigeenin hallita tehokkaasti korjata mutaatio, iskee hematopoieettisten järjestelmä. Ulkomaisten geenien käyttöönotto ESC: ssä mahdollistaa homotsygoottisten siirtogeenisten laboratorioeläinten rivit nopeutetulla nopeudella. On kuitenkin syytä huomata, että tekniikka on suunnattu rekombinaation geeni poistetaan luotettavasti toiminut toistaiseksi vain suhteellisen ESC-hiirissä. Käyttäen hiiren sosiaalineuvostojen kaksoispoistuma asennettu toiminnallinen rooli alueen geenien klusterin kromosomissa 7 (kopio genomisen alueen 19 minuuttia ihmisen kromosomin), ja proksimaalinen osa 11. Kromosomi (kopioi ihmisen 5d kromosomi) - poistetaan näiden geenien ESK-hiirillä annettiin mahdollisuus arvioida niiden analogien toiminta ihmisillä.

Kapasiteetin funktio tutkimukset ihmisen alkion geenien transfektiolla geeni, joka koe-eläinten annettiin hESCs erityisesti salauksen selventää rooli geenin välilehden ja muodostamalla sydänperäinen mesodermistä, pax-6-geeni - alkionkehityksessä silmään. On ensimmäinen geenien ilmentymistä epäkypsiä lisääntyvässä kortin ESC teratokarsinoomasoluissa ja blastokysti hiiret vahvistivat ylivoimainen sorron ESK transsignalizatsii geeneissä. Yhdistelmä mutantti sosiaalineuvostojen 60-80 ja 20-30 solut normaalin preimplantaatioal- hiiren alkioiden johtaa kehitystä kimeeristen alkioiden mitä kirjanmerkit elimissä koostuvat luovuttajan ja vastaanottajan soluja, jonka avulla voimme määrittää roolin tuntemattoman geenien gastrulaation ja organogeneesin. Funktionaalinen kartta geenin kehittää hiiren alkioiden suurennettuja yksityiskohtia rooli geeni SF-1 tab lisämunuaisen ja sukuelinten primordia WT-1-geenin - munuaisissa välilehden myod perheen geenejä - välilehden luuston lihaksen geeniperheessä Gata-1-4 - rajoittamiseen kypsymisessä erytro- ja lymfopoieesin alkeet.

Suunnattu pois äidin ja isän alleelit geenien hESCs vektorigrafiikan avulla rekombinaasin palveli selventää toimintoja eri geenien aikaisen alkionmuodostuksen ja teknologian kohdistaminen ihmisen tuntemattoman geenin hiiren sosiaalineuvostojen osaltaan löytämään uusia mutantti vastaavien geenien Vaikeiden perinnöllisiä sairauksia. Käyttämällä poistogeenisiä määritelty menetelmä obligatorinen merkitys joidenkin geenien annetun alkion kudoksia: gata-4 - infarktin, gata-1 - ja erytroidi hematopoieettisten kudosten, MyoD: - luurankolihaksessa, brachyury - ja mesodermistä rajoitus transkriptaaseis- hnf3 ja hnf4 - ja maksan kantasoluja, rag-2 - kirjanmerkit kloonien T-ja B-lymfosyytit (Repin, 2001). Kaksoishäviämämutanttien geenien hESCs on avannut pääsyä tutkimuksen toiminnallista roolia geenien itukerroksessa, segmentointi ja homeosis ja ESC elinsiirtoja annettava mahdollisuus saada sopivia lajihybridi alkioita. Parannettu menetelmät transplantaation luovuttajan PGC: itä yhdessä 8-alkioon osoitettu, että kimerisointi solutasolla monien elinten vastaanottajan alkion. Huomaa, että solu ituja löytyy ihmisen kudoksista resipienttihiiret elinten antamisen jälkeen ihmisen hematopoieettisten kantasolujen blastokystiin. Todettiin, että hiiren alkioiden muodostumisen aikana veren elinten kiertävän pluripotenttiset hESCs. On mahdollista, että niiden biologinen toiminta on järjestää tulevaisuudessa sikiön immuunijärjestelmää. ESC in vitro toistetaan riittävän mallit ihmisen geneettisen sairauden: kaksoispoistuma mallit dystrofiinigeenissä hiirissä Duchennen lihasdystrofia, sammutus atm-geenin (ohjaussignaali synteesi kinaasi kromatiinin) - ataksia-teleangektaziyu. Tässä tapauksessa, kohtalokas perinnöllinen sairaus lapsilla virheiden vuoksi DNA: n korjaamiseen kehittää rappeutumista Purkinjen solujen pikkuaivoissa, joka on liitettävä surkastuminen kateenkorva kuoleman vuoksi lisääntyvien solujen. Klinikalla, patofysiologia ja patomorfologija ataksia-teleangek- TazII jäljentää kautta kulkeutumisen TSK epänormaalin geneettisen informaation hiiristä kimeerien vastaavat ihmisissä. Lisäksi ataksia-teleangektazii käyttäen PGC: t ja hiirten kehitetty kokeellinen malli, jotkut perinnöllisiä homotsygoottinen ihmisen sairauksia, jotka liittyvät häiriöt hiilihydraatti- ja rasva-aineenvaihdunnan, kataboliaa aminohappojen poistaminen kuparin ja bilirubiini, joka lisäsi merkittävästi mahdollisuutta kokeellisen lääke esikliinisiä tutkimuksia uusien menetelmien asiaan liittyvien sairauksien hoitamiseksi henkilö.

[17], [18], [19], [20]

Kantasolusyytyhydraasin käyttö

Hybridi, jotka on saatu fuusioimalla somaattisia soluja hESCs, ovat riittäviä ja lupaavia malli tutkittaessa kantasolujen pluripotenssia ja uudelleenohjelmointi eriytetty kromosomeihin. Tsitogibridy saatu fuusion TSK kanssa erilaistuneita soluja aikuisen eläimen, antavat mahdollisuuden tutkia suhdetta genomien eri "ikäisiä": kehittää ainutlaatuinen tilanne, jossa homologinen kromosomien soluista peräisin eri erilaistumisen vaiheissa, ja eriasteisia kypsyyttä, ovat samassa tumaan, jossa ne voivat helposti transdeystvuyuschimi jakaa säätelysignaalit. On vaikea ennustaa, kuinka reagoida tsisregulyatornye epigeneettisiä järjestelmä homologisten kromosomien aikana olemassa olevista yn kun yksittäisen kehitys, vastauksena vaikutusten transdeystvuyuschih signaalit alkion liittyvien genomien. Lisäksi hybridisolut tapahtuu erillään vanhempien kromosomi, joka mahdollistaa vuorovaikutuksen tutkimiseen genomien erillinen kromosomissa tasolla, toisin sanoen, mahdollisesti tunnistaa osa tiettyjen kromosomien pluripotenttisuuden ylläpitämiseen, tai päinvastoin, tuotos eriyttämisessä.

Koska ensimmäinen kokeellinen malli tutkittaessa vuorovaikutusta genomien eri "historian kehitys" käytetään tsitogibridy saatu yhdistämällä teratokartsinomnyh pluripotentteja ja eriytetty somaattisten solujen. Joissakin tapauksissa tällaiset hybridisolut säilyttivät pluripotenttiominaisuudet riittävän korkealla tasolla. Erityisesti, in vivo somaattinen hybridi teratokartsinomno-solut indusoitiin kehittäminen totta teratomat johdannaisia sisältävät kaikki kolme alkio kerrosta, joka on in vitro suspensioviljelmissä muodostettu embryonaalisia. Jopa tämän tyyppinen lajien välisen tsitogibridov huomattava läsnä sikiön antigeenejä tapauksissa, joissa somaattiset kumppani sulautuminen teratokarsinoomasolua oli lymfosyyttejä tai tymosyyttien. On huomionarvoista, että tsitogibridy sulautumisen teratokartsinomnyh solut fibroblastien, sopusoinnussa fenotyypin fibroblasteissa.

Tärkeintä on, että havaittu, että in-teratokartsinomno somaattisten solujen hybrideistä, jotka näyttivät merkkejä genomin kyseeseen erilaistuneita soluja, tunnettu siitä, että aktivoituminen yksittäisten geenien tai inaktiivisia X-kromosomiin somaattisista kumppani. Siten, tutkimustulokset tyypin tsitogibridah teratokartsinomno-somaattisten solujen osoittavat, että hybridi-soluilla on usein säilytetään pluripotenssin ja uudelleenohjelmointi genomin, on merkkejä somaattisten kumppani.

Kokeissa saada alkion intraspecific hybridi-soluihin fuusioimalla pernasoluja hiiren sosiaalineuvostojen aikuisen eläimen tutkitut ominaisuudet, tsitogibridov, erottelu analyysi vanhempien kromosomien ja arvioidaan pluripotenttisuuden hybridi genomiin. Sillä lajihybridi jotka on tuotettu fuusioimalla teratokarsinoomasolua kanssa somaattisten solujen, yleensä tunnusomaista alhainen kromosomien segregaatiota kanssa tetraploideja tai lähes tetraploidinen karyotyyppi. Vastaava kromosomaalinen koostumus havaittiin sytosybridissä yhdistämällä primaariset sukupuoli-solut lymfosyyteillä. Samaan aikaan, lajihybridi saadut solut seurauksena fuusion hiiren lymfosyytin solun teratokartsinomnyh minkki, oli voimakas kromosomien segregaatiota somaattisten kumppani.

Laadullisesti uuden vaiheen tutkimuksessa erottelu vanhempien kromosomien risteytyksiä hybridit tuli sen jälkeen kehitys Mikrosatelliittimarkkerien analyysi menetelmällä käyttäen polymeraasiketjureaktiota, jolloin kukin hiiri kromosomi löytyy muutaman sadan markkereita, jolloin luotettavasti erottaa mikä tahansa pari homologisten kromosomien hybridisoluja.

Yhdistämällä ESK (käyttäen HM-1 solut, joista puuttuu gipoksantinfosforiboziltransferazy toimintaa, 2n = 40, XY, joka on eristetty blastokysteihin hiirikannasta 129 / 01a), pernasolujen hiirten kongeeniset linja DD / c eivät saaneet joukko kloonista morfologisesti oli samankaltaisuutta hESCs. Kaikki kloonit eristettiin selektiivisellä kasvualustalla, jossa kasvu on mahdollista vain aktiivisen solun gipoksantinfosforiboziltransferazoy. Elektroforeettinen analyysi paljasti, että läsnä kaikkien kloonien alleelinen variantti gipoksantinfosforiboziltransferazy ominaisuus hiiret DD / c. Käyttäen sytogeneettinen analyysi, havaittiin, että neljä oli kolme kloonista okolodiploidny asettaa kromosomeja. Yksi kohteen tetraploidinen klooni sisälsi kahden populaation hybridisolujen, joista yksi oli tetraploideja, ja toinen, pienempi - diploidi.

Analyysi Mikrosatelliittimarkkerien mahdollistaa erottamaan mikä tahansa pari homologisten kromosomien hiiren 129 / 01a ja DD / c hybridi kloonien okolodiploidnym sarja osoitti, että kloonit tapahtui kahdessa eri suosivista poistaminen autosomeiksi somaattisten kumppani. Useimmat autosomissa klooneja HESS2 ja HESS3 oli merkkiaineita, linja 129 / 01A, eli pluripotenttiset kumppani. Poikkeuksena oli kromosomiin 1 ja I: kloonit HESS2 ja HESS3, sekä markkereita HM-1-solut, pieni määrä läsnä olevia markkereita somaattisten kumppani. Nämä tulokset voivat heijastaa epätäydellinen kromosomien segregaatiota 1 ja ja somaattisten kumppani ja ovat yhdenmukaisia sytogeneettinen tietoja, jotka trisomia kromosomeja, jota esiintyy 30-40%: HESS2 ja HESS3 solukloonien. HESS4 klooni erosivat merkittävästi kromosomi koostumus: monet autosomeiksi Tämä klooni oli peräisin genomista ESK (kromosomien 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 ja 17), mutta kromosomeissa 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 ja 19 edustivat kummankin vanhemman homologit. Määräsuhde mikrosatelliittimarkkerin näiden homologisten kromosomien vastasi noin 1: 1. Tämä antoi tekijöille mahdollisuuden olettaa, että yksi homologi on johdettu ESC: n genomista ja toinen erilaistuneista soluista. Joissakin subklooneja kloonin HESS4 havaittiin vain symbolinen läsnäolo kromosomien 18 ja 19 somaattisten kumppani. Tulokset osoittavat, että solujen klooni HESS4, lisäksi kromosomien segregaatiota somaattisten kumppani, siellä oli poistaa toinen tai molemmat homologeja edellä kromosomin pluripotenttien genomiin, eli oli kaksipuolinen kromosomien segregaatiota molemmat vanhemmat - ilmiö on varsin epätavallista, koska tsitogibridov ominaisuus kromosomien segregaatiota vain toinen vanhemmista.

Lisäksi kun 20 kulkua, kaikki kloonit hybridisoluille sisältävät vain X-kromosomi merkkiaineiden somaattisen kumppanin, eli että kloonien tilalle X-kromosomin TSK X-kromosomissa somaattisen kumppani. Tämä vahvistetaan in situ -hybridisaatiodata käyttäen hiiren X-kromosomiin spesifistä FITC-leimatusta koettimesta: positiivinen signaali havaittiin vain yhdellä kromosomilla. On huomattava, että viljelyn aikaisemmissa vaiheissa (15. Vaiheeseen saakka) sytogeneettisten tietojen mukaan monissa soluissa oli kaksi X-kromosomia. Näin ollen, käyttämällä selektiivistä väliainetta avulla manipuloida kromosomaalinen koostumus hybridisolun ja suunnattu valita klooneja, jotka omaavat yhden kromosomin somaattisten kumppani sosiaalineuvostojen taustalla genomissa.

Ainutlaatuinen piirre genomin tsitogibridov on lokalisoinnin vanhempien genomien yhden ytimen, tietenkin, herättää kysymyksen ominaisuuksien ylläpitämisestä pluripotenttien alkion genomin ESC-somaattisten solujen hybridien olosuhteissa läheistä kosketusta genomin erilaistuneita soluja. Morfologisesti tsitogibridy PGC: t ja somaattiset solut olivat samanlaisia emolinjan hESCs. Arviointi pluripotenttisuuden osoitti, että kaikki kloonit okolodiploidnym asettaa kromosomien pystyivät muodostamaan suspension viljelmät embryonaalisia jossa johdannaisia kolmen alkio kerrosta läsnä.

Useimmat hybridisolut sisälsivät ECMA-7-antigeenin, joka oli varhaisten hiiren alkioiden ominaispiirre ja jolla oli myös korkea alkalisen fosfataasin aktiivisuus. Tehokkaimmat tiedot hybridisolujen korkeista pluripotenttiominaisuuksista saatiin kokeissa saadakseen sarjan injektiokemiraa, joihin sisältyi kloonin HESS2 hybridisolut. Biokemiallisten markkereiden analyysi osoitti, että useimmissa kimerakudoksissa löydettiin luovuttaja-hybridisolujen jälkeläisiä. Siksi ESC: n ja somaattisten erilaistuneiden solujen fuusioinnilla saadut hybridisolut pitävät pluripotentiaalia korkealla tasolla, mukaan lukien kyky muodostaa kimeerejä, kun ne asetetaan blasto- syystin onteloon.

Koneet HESS2 ja HESS4 erosivat merkittävästi vanhempien kromosomien koostumuksessa, mutta niillä oli samanlaiset pluripotenttiset ominaisuudet. Voisi uskoa, että pluripotentiaali hybridi-genomissa ilmenee hallitsevana piirteenä, mutta on mahdollista, että kaikki alkion genomin kromosomit eivät osallistu pluripotenssin ylläpitämisprosessiin. Jos tämä oletus on oikea, voidaan olettaa, että pluripotenttipartnerin joidenkin kromosomien poistaminen hybridoomas genomista ei liity pluripotenttitilan muutokseen. Tässä tapauksessa analyysit parenteraalisten kromosomien erottumisesta alkion hybridisoluissa mahdollistaisivat läheisen lähestymistavan kromosomien tunnistamiseen, jotka ovat vastuussa alkion solujen pluripotenssin kontrolloinnista.

Serov O. Et al (2001) joukossa 50 jälkeläisten saatu risteyttämällä kimeerit normaalien hiirten, jotka olisi genotyyppi hiiret 129 / 01a, ja kuljettavat X-kromosomi DD hiirillä. Kirjoittajat näkevät tämän syyn pluripotenssin vähenemisessä hybridisoluissa somaattisen genomin vaikutuksen alaisena. Vaihtoehtoinen selitys voi olla negatiivinen vaikutus trisomia joidenkin epätasapaino Autosomien ja sukupuolen kromosomeja (XXY havaittu soluissa jopa 15-passage) hybridi-solujen kulkua meioosin. Tiedetään, että XXY-solut eivät voi kulkea meioosin kautta ja muodostaa sukusoluja. Trisomi pystyy myös aiheuttamaan hybridisolujen proliferatiivisen aktiivisuuden vähenemisen, minkä seurauksena selektiivinen etu kimeerojen kehityksessä voi kuulua vastaanottajan alkion soluihin. Tästä seuraa, että hybridisolujen pluripotenttipotentiaalin arvioimiseksi on tarpeellista saada hybridiklooneja, joilla on normaali diploidinen kromosomisarja.

Kokeissa Serova O. Et al (2001) osoitettiin ensimmäisen mahdollisuuden ohjelmoida uudelleen X-kromosomi genomissa somaattisen solun hybridi solu. Tämä päätelmä tekijöiden ekspression analysoimiseksi kimeerien hprt-geenissä (X-kromosomin merkki): n läsnä ollessa alleelisia variantteja hprt DD / c-hiiriin havaittiin kaikissa kudoksissa analysoitiin kimeerinen. On syytä korostaa, että käyttöönoton jälkeen hybridi solujen blastokystin onteloon tsitogibridy kuuluvat ei-selektiivisissä olosuhteissa ja säilyttäminen X-kromosomi genomissa hybridisolut tarkoittaa, että se on tullut obligatorinen osa sen genomin eikä sen erottamiseksi Y-kromosomin pluripotenttien kumppani.

Yhteenveto tuloksista vuorovaikutuksen analysointi somaattisten ja pluripotenttien alkion genomiin hybridisoluja, kirjoittajat toteavat, että tietyissä tsitogibridah pluripotenttisuuden näkyy hallitseva ominaisuus. Hybridigeeni, joka pystyy yksittäisten kromosomien ohjelmoida erilaisia soluja, jotka, kuitenkaan, ei estä käänteinen vaikutus somaattisten genomissa pluripotenttisuuden alkion genomiin. Hybridisolujen viljelyssä erilaistumisen induktio tapahtuu paljon useammin kuin ESC NM-1: n alkuperäislinja. Samanlainen vaikutus on havaittu muodostuminen ensisijaisen pesäkkeitä: monet ensisijainen pesäkkeitä alkion hybridisoluille erilaistuneet alkuvaiheessa koulutuksen suurella menetys kloonien aikana jalostukseen ja lisääntymisen.

Siten, tsitogibridy sulauttamalla TSK kanssa somaattisten solujen, huolimatta tiiviissä yhteydessä genomin erilaistuneita soluja säilyttää pluripotenssin ainutlaatuinen piirre alkion genomiin. Lisäksi tällaisissa hybridisoluissa on mahdollista uudelleenohjelmoida hajotetuista soluista peräisin olevia yksittäisiä kromosomeja. On yhä epäselvää, miten hyvin säilynyt plyu- ripotentnye ominaisuudet alkion genomiin hybridi soluissa, erityisesti niiden kyky osallistua muodostumiseen ituradan kimeerien. Tätä varten on tarpeen saada alkion hybridisolut normaalilla karyotyypillä. Joka tapauksessa, alkion pluripotentteihin hybridi soluja voi olla todellinen malli geneettisen tunnistamisen kromosomien mukana pluripotenttisuuden ylläpitämiseen tai hänen ohjaus kahden- erillään vanhempien kromosomien potentiaalisesti tarjoaa tällaisen mahdollisuuden.

Ei vähemmän houkuttelevia ovat ilmiön tutkimus, jossa Serov G. Et ai (2001) määritelty "kromosomi- muisti." Hybridi-genomiin homologisella kromosomeista on kaksi vaihtoehtoista kokoonpanoja: homologeja somaattisten kumppani kerran tehty erilaistumista, kun taas homologit pluripotentteja kumppani, tämä prosessi on vasta alussa. Näin ollen, korkeat pluripotentteja ominaisuuksia hybridisolujen osoittaa, että "pluripotenttien" kokoonpano homologeja ESC melko vakaana hybridi genomien, vaikutuksesta huolimatta transdeystvuyuschih tekijöiden peräisin somaattisten kumppani. Edellä kuvatut piirteet uudelleenohjelmointi eriytetty homologisia genomin kromosomien kehityksen aikana kimeerojen eivät sulje pois mahdollisuutta, että ensimmäiset vaiheet muodostumista in vitro ja viljelemällä tsitogibridov ne säilyttävät asemansa hankitut erilaistumisen aikana in vivo. Uusimpien tietojen siirron yhteydessä alkion hybridi solujen ei-selektiivisellä alustalla, johon on intensiivinen poistaminen kromosomien vain somaattisten kumppani, eli genomi hybridisolujen erottaa helposti homologit jälkeen in vitro viljelmässä 10-15 kohtia. Siten, alkion hybridisolut edustaa lupaavaa kokeellinen malli tutkimus paitsi perusominaisuuksista alkion genomiin pluripotenssin, mutta myös sen vaihtoehtojen - alkion erilaistumisen.

Alkion kantasolujen siirron terapeuttinen tehokkuus

Ennen kuin ESC-transplantaation terapeuttinen tehokkuus ja niiden johdannaiset analysoidaan, tiivistetään edellä mainittu materiaali. Tarjolla TSK kannalta täysimääräisesti alkionkehityksen in vitro ovat riittämättömiä, koska vikoja tässä tapauksessa, koska ei ole mesenkymaalisia kantasoluja, joita esiintyy kehon itsenäisesti ja riippumattomasti hESCs. Geneettinen teho ESK vähemmän geneettistä potentiaalia tsygootit siis suoraan kloonaamiseksi alkioiden sosiaalineuvostojen ei käytetä. Ainutlaatuinen biologinen potentiaali hESCs ainoana solut, joissa kehittämisohjelmat käyttöön täysin johdonmukainen täytäntöönpano, löytyy sovellutuksia tutkimuksessa geenien toiminnan tutkimukset. Käyttäen ESK suorittaa dekoodaamalla ensimmäisen signaalin yhdistelmät, jotka aktivoivat ilmentymistä varhain ja myöhäisiä geenejä, jotka koodaavat kehityksen kolmen alkio kerrosta. Säilöntä genomin pluripotenttisuuden sosiaalineuvostojen in vitro tekee niistä ainutlaatuisen työkalu korjaus palautuminen, joka voi automaattisesti kompensoimaan solun menetykset vahingoittunut elimiä ja kudoksia. Ihanteellinen hypoteettinen suoritusmuodossa voidaan olettaa, että "... Elinsiirtoketjussa luovuttajan PGC: itä vastaanottajaorganismissa siirretään tiiviisti pakattu ohjelmien suotuisissa olosuhteissa on toteutettu rakennetaan uusia tkani'7 kykenee" ... Tehokkaasti integroitu vastaanottajan kehon morfologiset, sekä toiminnallinen että toiminnallinen. "

Luonnollisesti ESC: n monodifferenteitumismenetelmien kehittymisen jälkeen aloitettiin in vitro in vitro saadun solujen toiminnallinen aktiivisuus yhdestä erikoistuneesta kloonista. Lisääntyvä ESO-klooni tuottaa migraatio-esisolujen solujen populaatiot, jotka todella kykenevät aktiivisesti integroimaan vastaanottajan kudosvaurioalueisiin, joita käytetään regeneratiivisessa muovisessa lääketieteessä. On todettu, että Dopa-neuronien transplantaatio substantia nigraissa vähentää kliinisiä ilmentymiä kokeellisessa hemiparkinsonianismissa. Luovuttajien neuraalisten kantasolujen alueelliset siirrot vähentävät selkäytimen ja aivojen trauman tai supistumisen aiheuttamaa motoristen häiriöiden määrää. Saadut ja ensimmäiset positiiviset tulokset kantasolujen siirrosta demyelinaatiotauteissa. Näyttäisi siltä, että talous- ja sosiaalineuvostojen regeneratiiviset ja muoviset voimat avaavat rajoittamattomia mahdollisuuksia käyttää solujen siirtoa käytännön lääketieteessä. Kuitenkin, kun siirrytään ektooppisiin vyöhykkeisiin, ESC: t muuttuvat väistämättä kasvaimiksi. Kun ESC: n subkutaaninen injektio immuunipuutteisissa hiirissä muodostuu teratomeista. Kun istuttamisen kapselin alle lietteen ESK kiveksen syngeenisissä hiirissä on muodostettu teratoomat, joka koostuu eri kudoksissa, soluja, jotka ovat johdannaisia kaikki kolme alkio kerrosta. Tällaisissa teratomeissa organogeneesin vähentämisprosessit ovat erittäin harvinaisia.

Useissa tutkimuksissa antavat tietoa myönteiset tulokset varhaisen siirteen johdannaisten ESC eläimiä kokeellisesti ex-patologia. Solu neurotransplantation käyttäen johdannaisia PGC: t on edelleen kehitetty kokeessa ja ensimmäiset kliiniset tutkimukset korjaamisesta toiminnallisia häiriöitä aivojen ja selkäytimen trauma, hoito syringomyelian ja multippeliskleroosi (Repin, 2001). Kynnyksellä teknologian neyronogeneza sosiaalineuvostojen in vitro, sen sijaan että käytettäisiin alkion aivojen kudossiirtoihin kehitettyjä johdannaisia neuropallojen, viljelmistä saatuja alkion hermokudoksen. Kuten siirteen suspensio huomattavasti tasaisempi ja sitoutunut esiasteet käsittävät hermosolujen ja gliasoluja.

Lisäksi tavanomaisessa viljelyväliaineessa retinoiinihapolla annoksella 10 ug / ml 6 viikko sikiön linjat (teratoomat) NTERA-2 ihmisen -kartsinomy muodostettu yli 80% postmitoottisia neuronien. Täydellinen homogeenisuus hermosolupopulaatioaktiivisuuksien saavutetaan virtauksen lajittelemalla leimattu immunofenotyyppisiä merkkiaineita kypsien neuronien, jotka voivat päästä eroon jäänteitä teratokartsinomnyh ja kypsymättömiä soluja. Kuluttua siirrosta eri alueilla aivoissa koe-eläinten tällaisia hermosolut eivät ole vain hengissä, mutta myös upotettu alueellisia Neuroverkkojen. Eläimillä kokeellisiin malleihin paikallisten virheiden CNS neurotransplantation vähentää kliinisten oireiden ihmisen patologian, kuten vaikutuksia aivovamman, aivohalvaus, demyelinoivat sairaudet, perinnöllinen serebellaarinen kehitys vikoja, sairauksien lipidien saostuminen ja polysakkarideista.

Keskushermostoon liittyvien degeneratiivisten sairauksien regenerointiprosessien optimoimiseksi kehitetään tekniikoita myelin tuottavien oligodendrosyyttien valmistamiseksi ESK: sta. Ensimmäisessä vaiheessa perinteisesti on kyse ESC-yhdisteiden lisääntymisestä lisääntymisen edellyttämien solujen määrän lisääntymiseen. Toisessa vaiheessa suoritetaan solujen kohdennettujen erilaistumista myeliiniä tuottavien oligodendroyyttien esiasteiden populaatioon, jota kontrolloivat selektiiviset markkeriantigeenit.

Jotkut mahdollisuudet avataan käyttöön johdannaisia sosiaalineuvostojen kehittää menetelmiä korjaamiseksi aiheuttaman immuunikadon geenivirheet kypsymiseen kateenkorva. Tutkimuksissa poistogeenisillä (rag 1) hiirillä, joilla indusoitu geenivirhe - rikkominen rekombinaation mekanismi V (D) J-geenilokusten TCR, mikä johtaa funktion T-lymfosyyttien, elinsiirron aikaista johdannaisia PGC: iden kateenkorvassa eläinten talteen kypsymisen normaalin väestön immuuni kloonien vastaavan soluvälitteisen immuniteetin. Kliinisissä tutkimuksissa elinsiirtojen muotoon in vitro hESCs hoitoon kohtalokas perinnöllinen anemian lapsilla.

Kollektiivisen kantasolujen siirtämisen nopeasti klinikalla on perusteltua vastustaa rajoitettua määrää ihmisen alkion kantasolujen vakaita linjoja ja niiden standardointitarvetta. Standardoitujen ESC-linjojen ja aikuisten kantasolujen puhtauden lisäämiseksi ehdotetaan DNA-lyhyen tandem-toiston DNA-molekyyligeneettiseen analyysiin perustuvaa lineaarivalintamenetelmää. On myös tarpeen testata ESC-linjoja pienten kromosomaalisten uudelleenjärjestelyjen ja geneettisten mutaatioiden esiintymiseksi, niiden mahdollinen esiintyminen soluviljelyn olosuhteissa on riittävän suuri. Thesis ulottuu pakollista ominaisuuksien testaamiseksi kaikenlaisten PGC ja alueellisten pluripotentteja kantasoluja, koska niiden eteneminen in vitro voi aiheuttaa uusia ominaisuuksia ei luonnostaan kantasolut lopullisia tai kudoksiin. Erityisesti oletetaan, että pitkän aikavälin viljely väliaineessa, sytokiinien Hess lähempänä kasvainsoluihin, koska niitä esiintyy samanlainen muutos reittejä, joka säätelee solujen syklin kanssa hankinta kyky toteuttaa rajattoman määrän solunjakautumisten. Jotkut tekijät pitävät kasvainten kehittymisen perusteella ihmisten elinsiirtoa alkion kantasolujen varhaisten johdannaisten varastamattomina. Heidän mielestään on paljon turvallisempaa käyttää ESC: n, eli eriytettyjen solujen esi-isien, linjauksia. Luotettavaa tekniikkaa stabiilien ihmissolulinjojen saamiseksi, jotka erottavat oikeaan suuntaan, ei kuitenkaan ole vielä kehitetty.

Siten kirjallisuudessa on yhä enemmän tietoa ihmisen alkion kantasolujen johdannaisten transplantaation positiivisesta terapeuttisesta vaikutuksesta. Monet näistä teoksista ovat kuitenkin tarkistettavissa ja arvostelussa. Jotkut tutkijat uskovat, että tulokset aiempien kliinisten kokeiden ovat luonteeltaan alustava, ja vain osoittaa, että kantasolut kykenevät kohdistamaan suotuisa vaikutus kliinisen sairauden kulun. Siksi on välttämätöntä saada tietoja solutransplantaation pitkäaikaisista tuloksista. Argumenttina annetaan kliinisen neurotransplantaatin kehitysvaiheet. Todellakin, kirjallisuudessa, aluksi hallitsee julkaistu korkea hyötysuhde aivojen siirteiden fragmentit alkioiden Parkinsonin taudissa, mutta sitten alkoi ilmestyä raportteja kieltää terapeuttista tehoa alkion tai sikiön hermokudoksen transplantoitu potilaiden aivoissa.

Johti Ensimmäiset kliiniset kokeet turvallisuuden arvioimiseksi elinsiirtojen neuroblastiksi - johdannaiset PGC: t NTERA-2 teratokarsinooma, epäkypsiä soluja, jotka lisääntyvät viljelmässä tehtiin varastoinnin 100 miljoonas solumassaa. Osa näin saatua soluja käytettiin ominaisuuksien määrittämiseksi solun fenotyypin ja epäpuhtauksia, sekä testata aiheuttamaa saastumista virukset ja bakteerit. Kasvualustasta poistettiin LIF ja tukikerros stroomasolujen ja sikiön luonut edellytykset suunnattu erilaistumiseen hESCs osaksi neuroblastien yhdistelmä sytokiinien ja kasvutekijöiden. Sitten neuroblastit puhdistettiin epäkypsiltä teratokarsinoomasoluilta virtaushyytelajittimella. Sen jälkeen, kun toinen puhdistus ja karakterisointi fenotyypin siirrettyjen solujen neuroblastien (10-12 miljoonaa) suspensio käyttämällä erityistä ruiskua ja microcannulas stereotaxy ja valvonnassa CT ruiskutetaan tyvitumakkeesta aivojen potilaiden (seitsemännen kuukauden jälkeen verenvuotohalvaus). Odnogodovoy elinsiirron seulomalla vaikutuksia transplantaation neuronien iskualueen paljasti ei ole haitallisia ja ei-toivottuja vaikutuksia. Puolet potilaista kokenut parantuneen motorisen toiminnan aikana 6-12 kuukauden kuluttua elinsiirroista. Positiivisen kliinisen muutoksiin liittyi kasvu verenkierron iskualueen transplantaation jälkeen solut: keskimääräinen imeytyminen kasvu fluoresenssileimattuja 2-deoksiglukoosi, mukaan positroniemissiotomografia saavutti 18%, ja joillakin potilailla - 35%.

Kuitenkin Yhdysvaltain National Institutes of Health suoritti riippumattoman tutkimuksen kliinisestä tehosta potilailla, joilla on Parkinsonin Neurotransplantation. Potilailla ensimmäisen ryhmän osuudet siirretyn alkion hermokudoksen, jotka tuottavat dopamiinia, kun taas toinen ryhmä potilaita teki virheellinen toiminta. Tulokset osoittavat nolla kliininen teho tällaisten Neurotransplantation, vaikka dofaminprodutsiruyuschie alkion neuronien selvisi aivoissa vastaanottajille. Lisäksi 2 vuoden kuluttua siirrosta sikiön hermokudoksen 15%: lla potilaista kehittyi jatkuva dyskinesia, joka puuttuu lla lumelääkettä saaneiden ryhmässä (Kantasolut: tieteen kehitykseen ja tulevaisuuden tutkimuksen suuntiin Nat Inst, of Health USA ...). Näiden potilaiden taudin edelleenkehittämisen havainnot jatkuvat.

Jotkut kirjoittajat attribuutin ristiriitaisia kirjallisuudessa arviointi kliinisestä tehosta Neurotransplantation dataa erilaista lähestymistapaa valinnan potilasryhmät, riittämätön valinta tavoite menetelmiä, joilla arvioidaan niiden kunto ja, mikä tärkeintä, eri kehityksen kannalta sikiön hermokudoksen ja eri osissa aivoja, josta kangas on tuotettu eri kokoja siirto ja leikkauksen menetelmälliset ominaisuudet.

On huomattava, että yrittää ohjata transplantaation pluripotenttien alkion kantasolujen aivojuovioalue rottien aivoissa kokeellisen kehon gemiparkinsonizmom mukana TSK lisääntymistä ja niiden erilaistumista dopaminergisten neuronien. On syytä olettaa, että äskettäin muodostettu neuronien tehokkaasti rakennettu hermosolujen verkkoon sosiaalineuvostojen elinsiirron jälkeen havaittiin korjaus poikkeavuuksien käyttäytymisen ja moottorin epäsymmetrian apomorfiinin testi. Samaan aikaan osa eläimistä kuoli johtuen siirrettyjen ESK: n transformoinnista aivokasvaimeen.

Asiantuntijat Yhdysvaltain kansallisen ja Medical Academy, asiantuntijat National Institutes of Health uskovat, että kliininen potentiaalia hESCs ansaitsee vakavaa huomiota kuitenkin korostavat tarvetta varten yksityiskohtainen tutkimus niiden ominaisuuksia, todennäköisyyttä komplikaatioita ja pitkäaikaisia vaikutuksia kokeissa riittävän biologisen ihmisten sairauksien mallien (Kantasolut ja tulevaisuuden regeneratiivisen lääketieteen National Academy Press., Kantasolut ja tulevaisuuden tutkimuksen suuntiin. Nat. Inst, of Health USA).

Tästä näkökulmasta katsoen on tärkeää, että vertaileva histologista analyysiä kokeellisen teratooma saatu transplantaation kiveksissä lietteen PGC: iden kanssa teratoomat, jotka ovat kehittäneet vuoksi elinsiirtoa varhaisen alkion, joka sisältyy myös esillä olevan TSK osoitti, että ESK riippumatta niiden alkuperästä tai vuorovaikutusta ne tai muut ympäröivät solut samalla tavalla ymmärtävät niiden tuumorigeeniset voimat. Se osoitti, että tällainen teratomat on klonaalinen alkuperä, koska kasvain- sosiaalineuvostojen voi esiintyä, joka koostuu johdannaiset kaikki kolme alkiota kerrokset (.Rega, 2001). On huomionarvoista, että kun immuunijärjestelmän omaaviin hiiriin kloonattiin PGC: t, joilla oli normaali karyotyyppi ja muodostettu teratoomat, joka koostuu useita erilaisia erilaistuneiden somaattisten solujen. Nämä kokeelliset tiedot ovat täydellinen todiste teratomin kloonaalisesta alkuperästä. Näkökulmasta kehitysbiologian, ne viittaavat siihen, että se ei ole jaollinen esisolujen ja pluripotenttien kantasolujen identiteetti on lähde eriytetty johdannaisten kaikkien kolmen sukusolujen kerrosta, teratooman komponentteja. Kuitenkin käytännössä solutransplantaatiossa Näiden tutkimusten tulokset ovat, ellei kalliita, niin varoitusmerkki mahdollisesta vaarasta, koska siirrostus ESC tai alkuitusoluiksi eri kudoksissa aikuisten immuunivajavaisten hiirten väistämättä aiheuttaa kasvaimia transplantoiduista kantasoluista. Neoplastiset rappeuma ektopikaalisesti istutetut TSK mukana syntyminen satelliitin populaatioiden erilaistuneita soluja - osittain erilaistua on varmasti sosiaalineuvostojen ja kantaisä klooneja omistettu linjat. Mielenkiintoista on, että transfektoimalla ESC luustolihaksiksi teratokarsinoomasolujen vieressä, neuronit muodostuvat useimmiten. Kuitenkin annettaessa PGC: t Mace muna tai blastokysti liitettävä täydellinen integrointi sukusolujen ilman että muodostuu neoplastisten solujen. Samalla TSK upotettu lähes kaikissa elimissä ja kudoksissa alkion, mukaan lukien seksuaalinen surkastuma. Sellaiset allogeeniset eläimet saatiin ensin tuomalla teratokarsinooman solut 129 varhaisiin alkioihin 8-100 solujen vaiheissa. In allofennyh hiirillä populaatiot geterogenomnyh-soluista peräisin luovuttajan PGC: itä tuodaan luuydin, suoli, iho, maksa ja sukupuolielimissä, että voit luoda kokeessa jopa lajienvälisen solu kimeerien. Pienempi aikaan varhaisen alkion, sitä suurempi prosenttiosuus solun kimerisointi, korkein aste kimerisointi havaittu hematopoieettisen järjestelmän, ihon, hermoston, maksassa ja ohutsuolessa allofennogo alkio. Aikuisen organismin kudoksen myöntyväinen kimerisointi suojattu altistumiselta immuunijärjestelmän vastaanottajan gistogematicalkie esteet: siirteen alkuitusoluiksi kiveksessä parenkyymissä mukana insertoimalla luovuttajan kantasolujen vastaanottajalle kudokseen germenativny kerros. Kuitenkin, TSK elinsiirrot blastokystiin muodostelma kimeerinen primordia sukupuolielinten sukupolven luovuttajan alkuitusoluista ei tapahdu. TSK pluripotenttisuuden kun luo erityiset olosuhteet ja niitä voidaan käyttää kloonaukseen: TSK elinsiirrot hiiret 8-16-solu hiiren alkion, solun mitoosin jossa tsitokalazinom estetty, edistää normaalin alkionkehityksen kanssa alkion luovuttajan PGC: t.

Tästä seuraa, että vaihtoehto on transplantaation allogeenisten TSK terapeuttisen kloonauksen somaattisten solujen tumatransplantaatiota enukleoidusta oosyyttiin blastokystiin sisäsolumassasta josta jaetaan sitten rivi geneettisesti identtisiä luovuttajan PGC: itä somaattisten ydin. Teknisesti tämä ajatus on mahdollista, koska mahdollisuutta luomisen alkion kantasolujen linjat blastokysteihin saatu transplantaation jälkeen somaattisten enukleoituihin munasoluun toistuvasti osoittautunut kokeissa koe-eläimillä (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Erityisesti hiirissä, jotka olivat homotsygoottisia mutaation rag2, fibroblastit, joka on saatu viljelemällä subepidermaalinen kudoksen soluja käytettiin luovuttajan ytimet istutetaan enukleoidaan oosyyteissä. Aktivoinnin jälkeen oosyytit "tsygootti" viljellään, kunnes blastokysti muodostumista, mistä sisäsolumassasta on eristetty PGC: t ja kulkee ne linjan mutanttigeenin nullizigotnyh soluja (rag2 ~ / ~). Homologisella rekombinaatiolla tällaisissa ESC: issä yhden allelisen geenin mutaatio korjattiin. Ensimmäisessä koesarjassa päässä hESCs rekombinanttisen geenin talteen embryonaalisia valmistettiin, transfektoidut solut sen rekombinantilla retroviruksella (HoxB4i / GFP) ja etenemisen jälkeen hiirissä, joihin injektoitiin laskimon rag2 ~ / ~. Toisen sarjan tetraploidinen blastomeerejä yhteen muuntogeenisten hESCs ja siirrettyjen ne vastaanottajanaaraaseen. Syntynyt immunokompetenteilla hiirillä oli luuytimen luovuttajilta transplantaatiota mutanttihiirissä rag2 ~ / ~. Sekä sarja, tulos oli positiivinen: 3-4 viikkoa kaikissa hiirissä normaalin kypsä myeloidi- ja imusoluissa on löydetty, jotka kykenevät tuottamaan immunoglobuliineja. Siten, siirrettäväksi oosyyttiin somaattisten solujen voidaan käyttää ei ainoastaan tuottaa hESC linjat, mutta myös tsitogenoterapii - korjaus perinnöllinen poikkeavuuksia ESC vektorina liikenteen korjaamiseksi geneettisen informaation. Mutta tässä solu-elinsiirron suunnassa, bioetiikan lisäksi, on olemassa rajoituksia. Ei ole selvää, kuinka turvallinen elinsiirron olisi terapeuttisesti kloonata solut genotyypin identtinen genotyyppi tietylle potilaalle, koska sellaiset solut voivat mutaatioita, jotka luovat taipumusta tiettyihin sairauksiin. Normaalit ihmisen munat pysyvät saavuttamattomissa esine, kun taas vaikka siirron somaattisten enukleoituihin eläinten oosyyttiin vain 15-25% muokattuina "tsygootti" kehittävät blastokystivaiheeseen. Ei ole määritelty, kuinka paljon blastoyyttiä tarvitaan pluripotenttien kloonattujen ESC: iden yhden linjan saamiseksi. On huomattava, että terapeuttisen kloonausmenetelmän monimutkaisuuteen liittyvät rahoituskustannukset ovat korkeat.

Lopuksi, TSK pluripotenttisuusmarkkerin genomin hypomethylated DNA yhdistettynä korkeaan telomeraasiaktiivisuus ja lyhyt C ^ solusyklin vaihe, joka takaa intensiivisen ja potentiaalisesti ääretön kertolasku, jonka aikana PGC: t säilyttävät diploidinen kromosomeja ja "nuoruusiän" joukko fenotyyppisten ominaisuuksien. Klonaalista kasvua PGC: iden viljelmässä ei estä niitä erilaistumaan tahansa erikoistuneita solun organismin stop linjan proliferaatiota ja lisäämällä sopivia säätelysignaalit. Rajoitus erilaistumisen hESCs mukaisesti in vitro somaattisten solujen toteutetaan ilman osallistumista mesenkyymissä, ohittaen Nohteyaov, on organogeneesin ja ilman että muodostuu alkion. Ektooppinen in vivo annettaessa PGC: t väistämättä johtaa muodostumista teratokarsinoomasta. ESC elinsiirrot alkiorakkulaan tai varhaisalkion mukana niiden integrointi kudosten alkion ja sen vakaan kimerisointi elimissä.

Regeneratiivinen ja muoviset teknologiat perustuvat solutransplantaatiossa on leikkauspiste etujen jäsenten solubiologian, kehitysbiologian, kokeellinen genetiikka, immunologia, neurologia, kardiologia, hematologian ja monilla muilla aloilla kokeellisia ja käytännön lääketieteessä. Tärkein kokeelliset tulokset osoittavat mahdollisuutta ohjelmoimalla kantasoluja suunnan muutoksen niiden ominaisuuksien, mikä avaa mahdollisuudet ohjaamiseksi erilaistumaan prosesseja kasvutekijöiden - sydänlihaksen palautuminen, palauttaminen CNS vaurioiden ja normalisoi toiminta saarekkeiden laitteiston haima. Kuitenkin, laajamittaisen käyttöönoton transplantaation johdannaiset TSK lääketieteellisissä on tarpeen tutkia ominaisuuksia ihmisen kantasolujen yksityiskohtaisemmin ja edelleen kokeiluja PGC: iden kokeellisissa malleissa sairauksia.

Bioetiikan kysymykset ja ongelman allogeenisten solujen siirteen voisi ratkaista havaitun plastisuus genomin alueellisten aikuisen kantasoluja. Kuitenkin, ensimmäinen tieto on se, että kun siirron maksan eristetty ja perusteellisesti tunnettu autologisia hematopoieettisia soluja, joita on uusi hepatosyyttejä, sisällyttämällä maksan lobules, ovat nyt tarkistetaan ja kritisoitu. Kuitenkin, julkaistut tiedot, että transplantaation neuraalisten kantasolujen kateenkorva on muodostuu uusia versoja luovuttaja-T-ja B-lymfosyytit, ja siirtämällä neuraalisten kantasolujen aivojen luuytimessä johtaa muodostumista hematopoieettisten alkio jatkuva luovuttajan myeloidista ja erytropoieesia . Näin ollen aikuisten elimet voidaan säilyttää pluripotenttien kantasolujen, jotka kykenevät genomin uudelleenohjelmoinnin ESC kapasiteetin.

Lähde sosiaalineuvostojen lääketieteelliseen käyttötarkoituksiin pysyy ihmisalkion, joka määrää ennalta väistämättömyyteen uuden ylityksen moraalinen, eettinen, moraalinen, oikeudelliset ja uskonnolliset kysymykset origossa ihmiselämän. ESC: n löytäminen antoi voimakkaan sysäyksen kovaa keskustelua siitä, mistä elävien solujen ja aineen, aineen ja persoonallisuuden välinen viiva on. Samanaikaisesti ei ole yleismaailmallisia normeja, sääntöjä ja lakeja, jotka koskevat ESC: n käyttöä lääketieteessä huolimatta toistuvista yrityksistä luoda ja hyväksyä ne. Jokainen valtio lainsäädännössään ratkaisee tämän ongelman yksin. Omalta lääkärit ympäri maailmaa jatkavat yrittää saada regeneratiivisen, muovi pidemmälle tällaisia keskusteluja, mikä johtui pääasiassa muiden kuin alkion kantasolujen ja kantasolujen varaa aikuinen.

Osa alkioiden kantasolujen eristämisestä

Epämuotoisuus (alkio) solut eristettiin -kartsinomnye spontaanisti esiintyvistä kivesten teratomat hiirikanta 129 / ter-Sv, spontaani munasarjojen teratoomia hiiren linjat Lt / Sv, ja teratoomat, ektopichno lähde siirrettiin solut tai alkion kudosta. Keskuudessa Näin saatu epämuotoisuus stabiileja hiiren linjat (alkio) -kartsinomnyh jotkut solut ovat pluripotentteja, toiset alistettiin erilaistumisen ainoastaan soluissa, yhden tietyn tyypin, ja jotkut ovat yleensä kykenemättömiä erilaistumaan.

Tuolloin painopiste oli tutkimus, joka osoitti mahdollisen tuoton epämuotoisuus (alkio) -kartsinomnyh solujen normaalin fenotyypin niiden käyttöönoton jälkeen kehittyvässä alkiossa kudosta, samoin kuin työ luoda in vitro geneettisesti muunnetut epämuotoisuus (alkio) -kartsinomnyh soluja, joiden avulla mutanttihiiret saatiin ihmisen perinnöllisen patologian biologiselle mallinnukselle.

Kovettua suspensioviljelyä käytettiin teratemian karsinoomasolujen rivien eristämiseen. Viljelmässä epämuotoisuus (alkio) -kartsinomnye solut, kuten sosiaalineuvostojen, kasvaa muodostamiseksi embryonaalisia ja vaativat on käännettävä linja sitova dissosiaatio säilyttää pluripotenttisuuden on syöttölaite kerros alkion fibroblastien tai suspension viljelemällä vakioidun alustan. Epämuotoisuus pluripotenttien solujen (alkio) - karsinooma linjat suuri, pallomainen, on korkea aktiivisuus alkalisen fosfataasin, muoto aggregaatteja ja pystyvät monisuuntaisen erilaistumista. Kun ne viedään blastokystiin aggregoidaan kanssa morulat, jolloin muodostuu kimeeristen alkioiden, eri elimissä ja kudoksissa, jotka johdannaiset on havaittu epämuotoisuus (alkio) -kartsinomnyh soluja. Kuitenkin, valtaosa tällaisten kimeeristen alkioiden kuolevat kohdussa, ja elinten elossa kimeerien vastasyntyneen vieraiden solujen ja havaitaan harvoin, joilla on alhainen tiheys. Samalla kasvainten ilmaantuvuus (fibrosarkooma, rabdomyosarkooma, ja muita pahanlaatuisten turvotusta ja adenooma haima) voimakkaasti kasvaa, ja neoplastisten rappeutumista esiintyy usein jopa kohdussa kimeerinen alkioiden.

Suurin osa teratogeenikarsinoomasoluista normaalien alkion solujen mikroympäristössä lähes luonnollisesti hankkivat pahanlaatuisia neoplastisia ominaisuuksia. Uskotaan, että peruuttamaton maligniteetti johtuu proto-onkogeenien aktivoitumisesta rakenteellisten uudelleenjärjestelyjen prosessissa. Yksi poikkeus ovat solulinjat embriokartsinomnoy SST3, teratooman peräisin hiiren kives (line 129 / Sv-ter), joilla on korkea kyky integroida kudoksia ja elimiä sikiön ilman muodostamalla sen jälkeen kasvaimia kimeerisiä hiiriä. Teratemian karsinoomasolulinjojen johdannaiset chimerahiirissä eivät käytännössä osallistu primaaristen gonosyyttien muodostumiseen. On selvää, että on yhdistetty korkean taajuuden kromosomin poikkeavuuksien yhteisiä useimmille epämuotoisuus (alkio) -kartsinomnyh linjat, jossa solut havaitaan aneuploidia tai kromosomaalinen epänormaalius.

Laboratoriossa saatiin useita ihmisen terato-alkio-karsinoomien vakavia linjoja, joille oli ominaista pluripotentti, korkea proliferatiivinen aktiivisuus ja kyky erilaistaa kasvut viljelmissä. Erityisesti ihmisen terato-alkion karsinoomasolujen NTERA-2 linjaa käytettiin neuro-sytodi-diversifikaation mekanismien tutkimiseen. Sen jälkeen, kun tämän solulinjan solut siirrettiin vastasyntyneiden rottien ennaltaehkäisevän subventrikulaariselle alueelle, havaittiin niiden migraatiota ja neuronogeneesiä. On ollut edes yrittää elinsiirtoa hermosolujen epämuotoisuus saada viljelemällä soluja (alkio) -kartsinomnoy linja NTERA-2, potilaille, joilla on aivohalvauksia, joka laatijoiden mukaan, mikä johtaa kliinistä paranemista taudista. Samanaikaisesti teratogeenikarsinoomalinjan NTERA-2: n pahanlaatuisia siirrettyjä soluja ei havaittu potilailla, joilla oli aivohalvaus.

Ensimmäinen rivi erilaistumattomien Alkion pluripotenttien kantasolujen hiirten 80-luvun alussa-t viime vuosisadan sai Evans ja Martin, valitsemalla ne sisäsolumassasta blastokystan - embryoblast. Eristetyt ESC-linjat pitkään säilyttivät pluripotentiaalin ja kyvyn eriytyä erilaisiin soluihin erityisten viljelyväliaineiden tekijöiden vaikutuksesta.

Termi "alkioiden pluripotenttien kantasolujen" kuuluu Leroy Stevens, että tutkimus tupakan tervan vaikutus taajuus kasvaimen kehittymisen kiinnitti huomiota itsestään tapahtuvia kivesten teratokarsinooma lineaarinen (129 / v) hiirten kontrolliryhmässä. Kivesten teratokarsinoomasolua oli ominaista suuri lisääntymisnopeus, ja kun läsnä on nestettä jäljellä vatsaonteloon muodostumista spontaanin erilaistumisen neuronien, keratinosyyttien, kondrosyytit, sydänlihassolujen sekä hiusten ja luun fragmentteja, mutta ilman mitään viitteitä tilatun cytoarchitectonics sopiva kudos. Kun istutus teratokarsinoomasoluissa soluviljelmässä kasvatettu irrallaan alustan pluripotenttien kloonit ja muodostettu embryonaalisia sitten pysäytettiin ja suoritettiin spontaani fissiotuotteiden sekava erilaistua neuronien, glia, lihassolut ja sydänlihassolujen. Stevens havaittu, että teratokarsinooma hiiri 129 / v sisältää vähemmän kuin 1% soluja, jotka kykenevät erilaistumaan erilaisia erikoistuneita somaattisten linja, ja itse erilaistuminen riippuu tekijöistä, jotka vaikuttavat niiden (koostumus peritoneaalinesteessä, tuotteet lisätään viljelmään kypsien solujen tai kudosten). Leroy Stevenson oletus, että läsnä joukossa teratokarsinoomasolua alkion progenitorisolujen seksuaalinen itusolut vahvistettiin: suspensio embryoblast preimplantaation alkioiden solujen aikuisen hiiren kudoksissa on muodostettu teratokarsinooma, ja erottaa ne puhtaasta solulinjoissa intraperitoneaalisesti vastaanottajalle eläimet olivat erilaistuneet neuronien, sydänlihassolut ja muut somaattisen kletki johdannaiset kaikki kolme alkio kerrosta. Kokeissa in vivo transplantaatiota ESK (saatu embryoblast mutta ei trophoblast) hiiren alkioita eri vaiheissa linjat 8-32 blastomere päättyi kimeri- eläimen (kasvaimen muodostuminen) elimissä, jotka havaitsee ituja luovuttajan kudos. Kimerismistä havaittiin jopa linja sukusoluja.

Ensisijainen esisolujen sukusolujen eristettiin hiiren alkion itu sukupuoli, morfologia, immunologinen fenotyyppi ja toiminnalliset ominaisuudet sopusoinnussa hESCs peräisin teratokarsinooma Stevenson ja embryoblast. At kimeerien syntynyt annon jälkeen hESCs blastokystiin, allofenny elimen morfogeneesiä tunnettu mosaiikki vuorottelevat luovuttajan ja vastaanottajan rakenteellisia ja toiminnallisia yksiköitä maksan, keuhkojen ja munuaisten. Useissa tapauk- sissa havaittiin maksa-suoliston krypttien tai lobulojen muodostumista, jotka koostuivat samanaikaisesti vastaanottaja- ja luovuttajasoluista. Kuitenkin aina morfogeneesin toteutuminen tapahtui niiden lajien geneettisen ohjelman mukaisesti, joihin vastaanottaja kuului, ja kimerismi rajoitettiin pelkästään solutasolle.

Sitten havaittiin, että proliferaation hESCs ilman erilaistumaan on syöttölaite kerros mesenkymaalisia soluja (sikiön fibroblastit) tapahtuu, kun läsnä LIF sitoutumisen valikoiva ravintoalustalla, joka selektiivisesti antaa vain selviytymisen kantasolujen ja progenitorisolujen, kun taas suurin osa erikoistunut soluelementtien kuolee. Avulla näitä tekniikoita 1998 James Thomson osoitettiin viisi immortalisoituja riviä alkion kantasolujen sisäsolumassasta blastokystan henkilö. Samana vuonna John Gerhart on kehittänyt menetelmän, jossa eristetään kuolematon TSK linjat seksuaalisesta pullistaa neljän viiden viikon ihmisalkioita. Koska sen ainutlaatuisia ominaisuuksia, vasta kaksi vuotta myöhemmin alkion kantasolut ja kantasoluja lopullista kudos on alettu käyttää käytännössä regeneratiivisen lääketieteen ja geeniterapian.