Lääketieteen asiantuntija
Uudet julkaisut
Osteoartriitin kokeelliset mallit
Viimeksi tarkistettu: 18.10.2021
Kaikki iLive-sisältö tarkistetaan lääketieteellisesti tai se tarkistetaan tosiasiallisen tarkkuuden varmistamiseksi.
Meillä on tiukat hankintaohjeet ja vain linkki hyvämaineisiin mediasivustoihin, akateemisiin tutkimuslaitoksiin ja mahdollisuuksien mukaan lääketieteellisesti vertaisarvioituihin tutkimuksiin. Huomaa, että suluissa ([1], [2] jne.) Olevat numerot ovat napsautettavia linkkejä näihin tutkimuksiin.
Jos sinusta tuntuu, että jokin sisältö on virheellinen, vanhentunut tai muuten kyseenalainen, valitse se ja paina Ctrl + Enter.
Kouru on erittäin erikoistunut kudos, joka sisältää vain yhden tyyppisiä soluja (kondrosyytit), jolle on tunnusomaista veren ja imusuonien puuttuminen. Ruston ravinto suoritetaan pääasiassa imemällä synovial-nesteestä. Chondroosyyttien metaboliaa säätelevät useat liukoiset tekijät, joita kondrosyytit ja ympäröivä kudokset tuottavat paikallisesti. Chondrosyyttien toiminta riippuu myös solunulkoisen väliaineen (hapen jännitys, ionipitoisuus, pH jne.) Koostumuksesta, VCM-koostumuksesta, solu- ja matriisien vuorovaikutuksesta, fysikaalisista signaaleista. Kokeellisen mallinnuksen päätehtävä on kulttuurien syntyminen solunulkoisessa ympäristössä muuttamatta kypsän solun fenotyyppiä. Toinen tehtävä on luoda kulttuureja tutkittaessa kondrosyyttien ennenaikaista, viivästynyttä, lyhyttä tai pitkäaikaista reaktiota kemiallisiin ja / tai fysikaalisiin signaaleihin. Tutkimukset in vitro tarjoavat myös mahdollisuuden tutkia käyttäytymistä rustosolujen nivelrikko. Kolmas tehtävä on yhteisherkkyysjärjestelmien kehittäminen, joiden avulla voidaan tutkia eri kudosten yhteisvaikutuksia. Neljäs tehtävä on rustokasvien implanttien valmistelu myöhempää siirtoa varten. Lopuksi, viides tehtävä on tutkia kasvutekijöitä, sytokiinejä tai terapeuttisia aineita, jotka kykenevät stimuloimaan korjausta ja / tai estämään sen ruston resorptiota.
Viime vuosikymmeninä on luotu erilaisia nivelruston soluviljelmien malleja, mukaan lukien yksikerroksiset viljelmät, suspendoituneet viljelmät, kondronikulttuurit, eksplantit, kulttikivit, kuolemattomat soluviljelmät. Jokaisella kulttuurilla on sen edut ja haitat, ja kukin sopii erään Chondrosyyttien aineenvaihdunnan osa-alueen tutkimiseen. Siten ruskistetut eksplantaatit ovat erinomainen malli matriisielementtien liikevaihdon tutkimiseksi, mikä vaatii aitoja solun pintareseptoreita ja normaaleja solu-matriisia ja matriisi-solu-vuorovaikutuksia. Samanaikaisesti tutkitaan kerrostumien tutkimista matriisissa tai kondrottisen aineenvaihdunnan säätelymekanismeja suositellaan suoritettavaksi eristettyjen solujen viljelmässä. Yksiulotteinen pienitiheyksinen viljelmä on välttämätön solujen erilaistumisen prosessin tutkimiseksi. Luonnolliseen tai synteettiseen matriisiin suspendoituvat viljelmät ovat malli, jossa analysoidaan kondrosyyttien mukautuva reaktio mekaaniseen rasitukseen.
Kondrottikulttuureja
Kun rustokudosta valitaan in vitro -tutkimuksiin, on otettava huomioon useita tärkeitä kohtia. Chondrosyyttien matriisikoostumus ja metabolinen aktiivisuus vaihtelevat eri nivelissä, ja jälkimmäinen riippuu myös kudoksen kondrosyyttien syvyydestä. Nämä tiedot saatiin useissa kokeissa, joissa tutkittiin eri syvyyksien rustosyöhykkeistä peräisin olevien kondrosyyttien eristettyjä subpopulaatioita. Useita morfologisia ja biokemiallisia eroja löytyi pinnalla sijaitsevien viljeltyjen sukusolujen ja nivelruston syvien kerrosten välillä. Pinta-solut syntetisoivat harvinainen, tyhjentynyt proteoglykaani-fibrilleri-matriisi, kun taas syvemmät solut tuottavat matriisin, joka on runsaasti fibrilejä ja proteoglykaaneja. Lisäksi pinnalliset solut tuottavat suhteellisesti pieni aggregoitumattomia proteoglykaanien ja hyaluronihapon ja aggrekaani ja suhteellisesti pienempi kerataanisulfaatti, syvemmin sijaitsee kondrosyytit. Toinen merkittävä erotteleva piirre erilaisten syvyyksien rustosyöhykkeistä eristettyjen kondrosyyttien aineenvaihdunnassa on vastaus eksogeeniseen ärsykkeeseen. M. Aydelotten ja muiden kirjoittajien mukaan rustokondroytit ruston pintavyöhykkeestä olivat herkempiä IL-1: lle kuin syvän vyöhykkeen solut.
Solujen käyttäytyminen riippuu myös kudoksen sijainnista. Kondrosyyttien rusto ja korvan reunat, joka on otettu samasta eläimestä, jotka reagoivat eri tavalla kasvutekijät, kuten fibroblastikasvutekijä (FGF), ja TGF-beeta. FGF lisääntynyt tymidiinin, proliinin ja leusiinin kulttuurin kondrosyyttien kylkiluun mutta ei korvaan. TGF-P lisäsi tymidiinin rustoa kondrosyytit kylkiluun ja korvan, mutta ei ollut vaikutusta tymidiinin kondrosyyteiksi ja proliini korva. Rusto- solut saadaan alueita, joissa on suurin kuormitus, poikkeavat osat, joilla on alhainen kuormitus rustoa. Esimerkiksi kypsä kondrosyytit ruston polvinivelen keskialueelta lampaiden nivelen sääriluuhun pinta ei kuulu meniskin, joka kuljettaa suurimman kuorman in vivo, pienempi syntetisoitiin aggrekaania, dekoriini mutta suurempi kuin solujen aloilla nivelkierukan. Kirjoittajat korostavat myös tärkeää käyttää rusto nivelten identtisten alueiden tutkimuksessa synteettisen toimintaa nivelet.
Chondrosyyttien aineenvaihdunta ja niiden reagointi säätelijöihin riippuvat myös merkittävästi luovuttajan ikästä, sen luuston kehittymisestä ja niiden solujen tilasta, joista solut otetaan. Ihmisillä kondrosyytteillä havaitaan merkittävä väheneminen proliferatiivisen vasteen iän myötä. Suurin lasku on havaittu 40-50-vuotiailla ja yli 60-vuotiailla luovuttajilla. Lisäksi kasvutekijöiden proliferatiivisen vasteen vakavuus (esim. FGF ja TGF-beeta) vähenee ikääntymisen aikana. Kondrosyyttien lisääntymisen määrällisten muutosten lisäksi on myös laadullisia muutoksia. Nuoret luovuttajasolut (10-20-vuotiaat) vastaavat paremmin verihiutaleista peräisin olevaa kasvutekijää (PDGF) kuin TGF-beetalle, kun taas vasta-aineita havaitaan aikuisten luovuttajasoluissa. Jotta voitaisiin selittää kondrosyyttien synteettisestä toiminnasta johtuvat ikäkohtaiset muutokset ja niiden vastaus kasvutekijöiden vaikutukseen, käytetään useita mekanismeja. Niiden joukossa pintasolureseptoreiden määrän ja affiniteetin väheneminen, kasvutekijöiden ja sytokiinien synteesin ja bioaktiivisuuden muutos, jälkiseptorisignaalien modifikaatio.
Sidosten patologinen tila myös muuttaa kondrosyyttien morfologiaa ja metabolista aktiivisuutta. Niinpä, J. Kouri ja kirjailijat (1996) identifioivat kolme subpopulaatiota condrosyyttejä rustossa osteoartriittia vastaan. Ruusun pinnallisen ja ylemmän keskiasteen kondrosyytit muodostavat klustereita ja syntetisoivat enemmän proteoglykaaneja ja kollageenia. TGF-beeta, ja insuliinin kaltainen kasvutekijä (IGF) voi stimuloida proteoglykaanisynteesiä kondrosyyttien ja osittain neutraloivat vaikutukset IL-1 ja TNF-a. Rustoeksplantaatit oli kärsii nivelrikko, ja kondrosyytit eristettiin rusto nivelrikkopotilailla, ovat herkempiä stimulaation TGF-beeta kuin terveillä ruston kondrosyyttien. Nämä erot johtuvat todennäköisesti fenotyyppisistä muutoksista condrosyytteissä nivelruston yläkerroksissa.
Yksittäisten kondrosyyttien eristäminen saadaan aikaan peräkkäisellä käsittelyllä ECM: n proteolyyttisten entsyymien kanssa. ECM: n vapautumisen jälkeen eristetyt solut sopivat erinomaisesti de novo -matriisikomponenttien synteesin tutkimiseen . Jotkut tekijät käyttävät vain klostridiumin kollagenaasia, toiset esi-inkuboivat rustoja trypsiinin, pronaasin, DNaasin ja / tai hyaluronidaasin kanssa. Eristettyjen solujen määrä riippuu käytetyistä entsyymeistä. Näin ollen, kun käsitellään yksi 1 g kollagenaasia kudosta voidaan saada 1,4T0 6 kondrosyytit, kun taas käytettäessä pronaasilla, hyaluronidaasin ja kollagenaasi - 4,3-10 6. Kun kollagenaasi, aggrekaani, proteiinit, IL-6, IL-8 jalostetaan soluviljelmässä paljon enemmän kuin kun kyseessä on peräkkäinen käsittely erilaisilla entsyymeillä. Näiden erojen välillä on useita selityksiä kahden soluviljelmän välillä:
- Solureseptoreihin vaurioitunut tai masentunut entsyymien, TGF-beeta estää DNA-synteesiä proteoglykaanien hiljattain eristetty kondrosyytit (päivä 1), kun taas DNA: n ja proteoglykaanin synteesiä kondrosyyttien viljeltiin yksikerroksisessa (7 päivä) stimuloivat TGF-beeta. Näiden membraanikomponenttien uudelleen ilmaisemiseen tarvitaan kuitenkin riittävä aika ennen kokeen alkua.
- Eksogeeniset proteaasit voivat katkaista solujen ja matriisin vuorovaikutuksen, jota integriinit välittävät. Integriiniryhmä edistää kondrosyyttien kiinnittymistä VKM-molekyyleihin (Shakibaei M. Et ai., 1997). Tämä rikki voi vaikuttaa matriisigeenien ilmentämiseen.
- Matriisikomponenttien jäännökset voivat säätää kondrosyyttien synteettistä toimintaa. Integriinit kykenevät tunnistamaan ECM: n hajoamistuotteita, joilla on näin tärkeä osa kudosten korjauksessa proteolyyttisten entsyymien altistumisen jälkeen. T. Larsson et ai (1989) raportoivat, että lisäämällä ehjä tai hajanaiset proteoglykaanien viljellyissä soluissa stimuloi proteiinien synteesiin ja proteoglykaanien. Kuitenkin, korkea hyaluronihappoa aiheuttaa merkittävän vähenemisen sulfaattia proteoglykaanisynteesiä kondrosyyttien kanan alkion kondrosyyttien kypsä sian ja rotan kondrosarkoomasoluissa. Lisäksi, hyaluronihappoa - inhibiittori proteoglykaanin vapautumisen soluista myös kun läsnä oli IL-lb, TNF-a: n, FGF, joka ilmaisee, että ensimmäinen torjumaan biologista aktiivisuutta kasvutekijöiden ja sytokiinien. Tarkka mekanismi, joka perustuu hyaluronihapon toimintaan, jää epäselväksi; Tiedetään, että kondrosyytit sisältävät hyaluronihapon reseptorin, joka liittyy sytosolin aktinifilamentteihin. Hyaluronihapon sitoutuminen sen reseptoriin stimuloi proteiinien fosforylaatiota. Näin ollen, nämä tulokset osoittavat metabolisia moduloimaan toimintoja natiivin rustosolujen tai hajanaiset molekyylit matriksin proteiinien aktivoimalla solukalvoreseptorien.
- Kondrosyyttien matriisiproteiinien synteesin nopea stimulointi entsyymien kautta voi johtua kondrosyyttien muodon muutoksesta ja / tai sytoskeletonin uudelleenorganisoinnista.
- Eräät sytokiinit (esim. IL-8) ja kasvutekijät (esim. IGF-1, TGF-P) on kiinnitetty ECM: ään. Tunnetuin esimerkki on TGF-beetan sitoutuminen dekoraalilla, mikä johtaa entisen kyvyn heikentymiseen solukasvun indusoimiseksi munasarjasoluissa kiinalaisissa hamstereissa. Tiedot siitä, että rustikoristuksen sisältö kasvaa iän myötä, osoittavat, että TGF-beetan biologinen hyötyosuus vanhenee. Kasvutekijät ja sytokiinit voidaan vapauttaa matriisijäännöksistä viljelyn aikana ja moduloida kondrosyyttien toiminta.
[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]
Kondrosyyttien monosulkukulttuuri
Kondrosyyttien eriytettyä fenotyyppiä karakterisoidaan ensisijaisesti tyypin II kollageenin ja kudosspesifisten proteoglykaanien synteesi sekä alhainen mitotista aktiivisuutta. On näyttöä siitä, että pitkäaikainen viljely solujen yksikerroksisen, ja sen jälkeen useita toistuvan kohtia soluja, kondrosyyttien menettävät pallomainen muoto, tulee pitkänomainen, fibroblastin kaltainen muoto. Tällaisia fibroblasti metaplasiaa synteettinen toiminto on myös modifioidut solut, tunnettu siitä, että jatkuva pieneneminen synteesissä kollageenien II, IX ja XI tyypit ja parannetut kollageenin I, III ja Utipov. Pienet, ei-aggregoituneet proteoglykaanit syntetisoidaan funktionaalisen aggrekaanin avulla. Syntatsatapsiini B ja L ovat erittäin pieniä eriytetyissä soluissa, mutta erilaistumisen menetys kasvaa. Kollagenaasi-1 ekspressoituu erilaistuneissa kondrosyytteissä, joilla on pitkäaikainen viljely, sen ekspressio vähenee, kun taas metalloproteaasien kudosinhibiittorien (TIMP) tuotanto kasvaa.
Eriytetty kondrosyytit ilmaisevat uudelleen erilaistuneen fenotyypin kollageenin, kun ne siirretään yksikerroksisesta viljelmästä suspendoituun. Differentiaation prosessi liittyy luultavasti solujen muotoon. Tätä ominaisuutta käyttävät säännöllisesti tutkijat, jotka tutkivat viallisia elinsiirtoja autologisilla kondrosyytteillä. Pieni määrä biopsia-materiaalista saatuja soluja voidaan kertoa yksikerroksisessa viljelmässä ja sitten sijoittaa uudelleen kolmiulotteiseen matriisiin ennen siirtoa. Uudelleen ilmentymisen spesifisen fenotyypin dedifferentoituneiden kondrosyytit kulkeutuivat agaroosia kulttuuri, voidaan stimuloida TGF-p-osseiinia hydroksiapatiitista monimutkainen ja askorbiinihappo.
Vastauksena kasvutekijöiden ja sytokiinien vaikutukseen kondrosyytit muunnetaan eriyttämisprosessin aikana. Solukasvaisuus sytokiineille ja kasvutekijöille eroaa erilaistumattomien ja erilaistuneiden kondrosyyttien välillä. IL-1 stimuloi fibroblastien proliferaatiota, kun taas IL-1 estää erilaistumattomien kondrosyyttien kasvua. IGF-1 stimuloi DNA: n synteesiä pitkänomaisissa, mutta ei litistetyissä kondrosyytteissä. Eriytetyissä kondrosyytteissä IL-1β: n ja TNF-a: n stimuloivat vaikutukset prokollagenaasituotteisiin ovat voimakkaampia kuin erilaisissa.
Kondrosyyttien viljely
Kondrosyyttien viljely suspensiossa nestemäisessä väliaineessa tai luonnollisessa tai synteettisessä kolmiulotteisessa matriksissa vakauttaa kondrosyytin fenotyyppiä. Solut säilyttävät pallomaisen muodonsa, syntetisoivat kudosspesifisiä proteiineja. Painotettua kondrosyyttiviljelmää suositellaan yleensä uuden perisellulaarisen matriksin muodostumisen tutkimiseksi. Synteettisissä tai luonnollisissa absorboivissa polymeereissä käytettyjä kondrottikulttuureja käytetään solujen implantoimiseen rustovirheisiin stimuloimaan nivelen rustokudoksen regeneroitumista. Synteettisen tai luonnollisen ympäristön implantoitavien solujen on täytettävä useita vaatimuksia:
- Implantaateilla tulisi olla huokoinen adheesion ja solukasvun rakenne,
- ei itse polymeeri eikä sen hajoamistuotteiden pitäisi aiheuttaa tulehdusta tai myrkyllisiä reaktioita in vivo implantaation aikana ,
- siirrännäisen kantajan olisi kyettävä sitomaan vierekkäiseen rustoon tai subkonderaaliseen luuhun,
- luonnollisen tai synteettisen matriisin on kyettävä absorboimaan, sen hajoaminen on tasapainotettava kudoksen uudistamisella,
- Ruston korjaamisen helpottamiseksi matriisin kemiallinen rakenne ja matriisiarkkitehtuuri auttaisivat ylläpitämään solukalvotyyppiä, joka oli insertoitu kondrosyytteihin ja kudosspesifisten proteiinien synteesi,
- implantaation aikana in vivo on tarpeen tutkia synteettisen tai luonnollisen matriisin mekaanisia ominaisuuksia.
[18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25]
Chondrosyyttien suspensio nestefaasissa
Solun tarttuminen muoviastioita, jossa kondrosyyttien viljelyyn, voidaan estää niiden seinät päällystetään liuoksella, metyyliselluloosa, agaroosi, hydrogeelin (poly-2-hydroksietyylimetakrylaatti) tai seosta, jossa kollageeni-agaroosia. Näissä olosuhteissa kondrosyytit muodostavat klustereita ja syntetisoivat lähinnä aggrekaania ja kudosspesifisiä kollageeneja (II, IX, XI-tyyppejä). Yleensä kahdenlaisia soluja löytyy. Keskuksessa sijaitsevat solut säilyttävät pallomaisen muodon, jota ympäröi hyvin kehittynyt ECM, jota vahvistavat histokemialliset ja ultrastruktuuritutkimukset. Kehäkondrosyytteillä on discoidisia ääriviivoja, joita ympäröi harvinaista ECM; Tällaisten solujen toiminnallisista ominaisuuksista tiedetään vähän.
Chondrosyyttien viljely suspensioon tuetuilla mikrokantoaalloilla on mahdollista; Mikro-kantoaineina käytetään dekstraanipalloja (cytodex), kollageenipäällysteisiä dekstraanipalloja (cytodex III), ei-tyhjiä kollageenityyppisiä mikropalloja (kollageeni). Näissä viljelyolosuhteissa kondrosyytit kiinnittyvät mikrokantajan pinnalle, säilyttävät pallomaisen muodon ja tuottavat matriisimäisen materiaalin. Lisäksi kollageenin käyttö edistää kondrosyyttien proliferaatiota ja normaalin fenotyypin uudelleen ilmaista- mista. Siksi kondrosyyttien viljelyä kollageenin mikropalloissa voidaan käyttää solufenotipin palauttamiseksi ennen transplantaatiota.
Toinen menetelmä kondrosyyttien suspensiota viljellään nestemäisessä väliaineessa on niiden viljely tiheiden helojen muodossa, jotka koostuvat soluista (0,5-1 x 10 b ), jotka on saatu sentrifugoimalla. Tällaiset kondrosyytit pystyvät tuottamaan matriisin, joka sisältää suuria määriä proteoglykaanien, II-tyypin kollageenia, mutta ei tyypin I kollageenia, joka vahvistettiin histologisella, immunohistokemiallisia ja kvantitatiivisia menetelmiä.
Chondrosyyttien suspensio luonnollisessa ECM: ssä
Kondrosyytit voidaan viljellä suspensiossa kolmiulotteisen matriisin (pehmeä agar, agaroosi, soita geenit geeli tai sienellä, hyaluronihappoa, fibriiniliimaa, alginaattihelmistä).
Viljellyt agaroosi-kondrosyytit säilyttävät normaalin fenotyypin ja syntetisoivat kollageenityyppiset II ja kudosspesifiset aggregoitavat uudet aggregaatit. Agaroosilla viljeltynä solutason syntetisoidut proteoglykaanit vapautuvat elatusaineeseen 50 päivän ajan. Vertailua varten - yksikerroksisessa viljelmässä solufaasi on täynnä glykosaminoglykaaneja jo ensimmäisten 5-6 päivän viljelyn aikana; kun sitä viljellään väliaineessa sen jälkeen, kun glykosaminoglykaaneja on syntetisoitu ja vapautunut, tehostetaan glykosaminoglykaanien aikasektorin vähenemistä ensimmäisten 8-10 päivän aikana. Kuitenkin kondrosyyttien käyttäytyminen niiden viljelyn aikana agaroosissa eroaa in vivo -olosuhteista. Agaroosissa lukuisat syntetisoidut Aggregan-aggregaatit sisältävät pienempiä ja pienempiä molekyylejä kuin in vivo. TGF-P stimuloi proteoglykaanien synteesiä eksplantaatiossa, mutta vähentää aggreanin synteesiä agaroosissa.
Alginaatti on lineaarinen polysakkaridi, joka on johdettu ruskeasta merilevästä. Divalenttisten kationien, kuten Ca 2+ -ionien, läsnä ollessa tämä polymeeri muuttuu geeliksi. Kukin kondrosyyttien kiinni alginaatti, jota ympäröi matriisin negatiivisesti varautuneiden polysakkaridien, joiden huokoset ovat verrattavissa hyaliinirustoa. Matriisi, joka muodostuu kondrosyytit alginaattihelmissä, joka koostuu kahdesta segmentistä - ohut kerros soluun liittyvän vastaavan matriisin perisellulaarinen ja alueellinen matriisit nivelruston ja kauempana matriisi alueiden välinen vastaava luontainen kudos. 30. Päivänä viljelyn, suhteellinen ja absoluuttinen tilavuutta soluja, ja kummankin osastojen alginaatin helmi on lähes täysin samanlainen kuin natiivin rustoa. Lähes 30 päivä kondrosyyttien säilyttävät pallomainen muoto ja tuottaa aggrekaani, hydrodynaaminen ominaisuudet, jotka ovat samanlaisia kuin aggrekaanin molekyylien matriisin nivelruston ja kollageenimolekyyliä II, IX ja XI tyyppejä. Samaan aikaan, kuten muut viljelmät, suspensiot, alginaattihelmissä pinnalla litistetty solut ovat läsnä joka tuottaa pienen määrän tyypin I kollageenin molekyylejä, päästetään suoraan ympäristöön ja joita ei ole sisällytetty videonauhuri. Alginaattihelmissä havaitaan kohtalaisen prokarii- noitumista kondrosyytteihin. Jälkeen 8kuukausi viljelyn alginaattigeeliä kypsä kondrosyyttien eivät menetä metabolista aktiivisuutta ja edelleen syntetisoida kudosspesifisiä tyypin II kollageenin ja aggrekaanin.
N. Tanaka ja coauthors (1984) tutkivat erilaisten luonnollisten molekyylien diffuusiomaisuutta alginaatissa ja havaitsivat, että 70 kD: n suuruiset molekyylit eivät hajoa alginaatin läpi. Niinpä solujen viljely alginaatissa soveltuu matriisien biosynteesin säätelyyn ja ECM: n organisointiin. Alginaatissa viljeltyjen solujen saatavuus mahdollistaa peptidisääteisten tekijöiden ja farmakologisten aineiden vaikutuksen transkription, posttranskription ja translaation tasojen tutkimiseen.
Kondrosyyttejä viljellään myös kollageenikuitujen I ja II tyypeissä. Nehrer et ai (1997) vertasivat toiminta koirilla kondrosyyttien proteoglykaanilinkki erilleen Kollageeni-polymeerimatriisi, joka sisältää kollageenit erilaisia. He havaitsivat merkittäviä eroja morfologiassa biosynteettisen toimintoja kondrosyyttien viljeltiin kollageenia sisältävä matriisi kollageenin tyyppi I ja II. Solut matriisin tyypin II kollageeneista sohryanyali pallomaisen muotonsa, kun taas I-tyyppinen kollageeni oli fibroblastin kaltainen morfologia. Lisäksi tyypin II kollageenin matriisissa kondrosyytit tuottivat enemmän glykosaminoglykaaneja. J. Van Susante et ai. (1995) vertailivat alginaatti- ja kollageenin (tyypin I) geelin viljeltyjen kondrosyyttien ominaisuuksia. Kirjoittajat havaitsivat merkittävää kasvua solujen määrä kollageenigeeliä, mutta 6. Päivänä viljelyn jälkeen solut menettivät ominaisuus fenotyyppi, muuttui fibroblastin tapaisia soluja. Alginaattigeelissä havaittiin solujen lukumäärän vähenemistä, mutta kondrosyytit säilyttivät normaalin fenotyypin. Määrä kollageenigeeliä proteoglykaanien solua kohden olivat merkittävästi korkeampia kuin alginaatin, mutta lasku havaittiin geelimatriisista elementit synteesi alkaen 6. Päivänä viljelyn, kun taas alginaatti synteesi jatkui.
Kiinteä kolmiulotteinen fibriinimatriisi on luonnollinen aine, joka tukee sitä punnittuja kondrosyyttejä erilaistetussa fenotyypissä. 3D-fibrinimatriisia voidaan myös käyttää kantajana kondrosyyttien siirtämiseen. Fibrinin edut ovat sytotoksisuuden puuttuminen, kyky täyttää tila, liimauskyky. Histologiset ja biokemialliset tutkimukset Autoren-diografii, elektronimikroskoopilla paljasti, että rustosolujen fibriinigeeleillä säilyttävät morfologia, lisääntyä ja tuottaa matriisin, vaikka 2viikko viljelyn. Kuitenkin, G. Homminga et ai (1993) raportoivat, että kun 3 päivä viljelyn, alkaa hajoaminen fibriinin etenee erilaistamattomuus kondrosyyttien.
Chondrosyyttien suspensio keinotekoisessa (synteettisessä) ECM: ssä
Rustorakenteita rekonstruoivaan tai ortopediseen leikkaukseen voidaan saada kasvattamalla eristettyjä kondrosyyttejä in vitro synteettisessä, biologisesti yhteensopivassa matriisissa.
Viljellyt polyglykolihappo-kondrosyytit proliferoituvat ja ylläpitävät normaalia morfologiaa ja fenotyyppiä 8 viikon kuluessa. Hondrosyytti-polyglykolihapon kompleksi koostuu soluista, glykosaminoglykaaneista, kolageneista ja sillä on ulkoinen kollageenikapseli. Kuitenkin tällaisissa implantteissa on kahta tyyppiä kollageenimolekyylejä - I ja II. Implantit dedifferentoituneiden kondrosyyttien sarjan kohtia, on suurempi määrä glykosaminoglykaanien ja kollageenin kuin implantit erilaistumattomien primaarikondrosyyttien.
L. Freed et ai (1 993b) verrattuna käyttäytymiseen kondrosyyttien viljelmistä ihmisen ja naudan kuitumainen polyglykolihappo (EQAP) ja ristiriita polilaktilovoy happo (PPLC). Kun 6-8 viikon kuluttua sonnien kondrosyyttien viljelyn HSVG: ssä tai PPLC: ssä, tekijät havaitsivat solujen lisääntymisen ja rustomatriisin regeneroinnin. HSBC: ssä kondrosyytit olivat pallomaisia, ja ne sijaitsivat kaduilla, joita ympäröi rustomainen matriisi. 8 viikon in vitro -viljelyn jälkeen regeneroitu kudos sisälsi jopa 50% kuiva-ainetta (4% solumassasta, 15% glykosaminoglykaaneista ja 31% kollageenista). PPLK-soluissa oli karan muotoinen, pieni määrä glykosaminoglykaaneja ja kollageenia. HSBC: ssä solujen kasvu oli 2 kertaa voimakkaampi kuin PTCA: ssa. In vivo -olosuhteissa HPVC: ssä ja PPLC: ssä kasvatetut kondrosyytit 1-6 kuukautta tuottavat histologisesti samanlaisen kudoksen kuin rustot. Implantit sisälsivät glykosaminoglykaaneja, tyypin I ja tyypin II kollageeneja.
Sikiön sonni-kondrosyyttejä viljeltiin huokoisessa suuritiheyksisessä hydrofobisessa ja hydrofiilisessa polyetyleeni. Sekä substraattien inkubaation 7 päivän jälkeen solut säilyttivät pallomaisen muodon, joka pääasiassa sisälsi tyypin II kollageenia. 21 päivän viljelyn jälkeen kävi ilmi, että hydrofiilinen matriisi sisältää enemmän tyypin II kollageenia kuin hydrofobinen matriisi.
Rustikudosta voidaan myös saada viljelemällä yksisolukerroksessa Millicell-CM-suodattimilla. Suodattimien esipäällystäminen kollageenilla on välttämätöntä kondensaattoreiden kiinnittämiseen. Kulttuurin histologinen tutkimus osoittaa kondrosyyttien kerääntymistä ECM: ään, joka sisältää proteoglykaaneja ja tyypin II kollageenia. Kollageenityyppiä I ei tällaisessa viljelmässä tunnisteta. Kondrosyytit tuloksena olevassa rypistyneessä kudoksessa ovat pallomaiset, mutta kudoksen pinnalla ne litistyvät jonkin verran. Hiljattain muodostuneen kudoksen paksuus kasvoi ajan myötä ja riippui solujen yksisolukerroksen alkuperäisestä tiheydestä. Optimaalisissa viljelyolosuhteissa rustokudoksen paksuus saavutti 110 pm, sen solujen ja kollageenin organisointi pinnalla ja syvällä kerroksella on samanlainen kuin nivelrustin. VKM sisältää noin kolme kertaa enemmän kollageenia ja proteoglykaaneja. 2 viikon viljelyn jälkeen havaittiin matriisi-sa: n kertyminen, mikä mahdollisti kudoksen uuttamisen suodattimesta ja käyttää sitä transplantaatiota varten.
Sims et ai. (1996) tutkivat kondrosyyttien viljelyä polyetyleenioksidigeelikapseloidussa polymeerimatriisissa, joka sallii suuren määrän soluja kuljetettavaksi injektiolla. Kuusi viikkoa injektion jälkeen aivojen hiirien ihonalaisessa kudoksessa muodostui uusi rusto, jonka morfologisesti oli ominaista valkoisen opalesenssin, joka oli samanlainen kuin hyaliinirypos. Histologisista ja biokemiallisista tutkimuksista saadut tiedot osoittivat aktiivisesti lisääntyvien kondrosyyttien läsnäoloa, jotka tuottavat ECM: n.
Explantation
Ristikkäisen kudoksen tutkimista käytetään tutkimaan sen ana- ja kataboliaa, homeostaasia, resorptiota ja korjausta. Ruusukudoksen kudosrepastiiveissa esiintyvät kondrosyytit tukevat ECM: n normaalia fenotyyppiä ja koostumusta, samanlaisia kuin nivelrustossa olevat in vivo. Viiden vuorokauden viljelyn jälkeen seerumin läsnä ollessa saavutetaan vakio synteesi ja luonnollinen hajoaminen. Resorptio voi nopeuttaa kudosviljelmässä ja pääviljelmässä, johon on lisätty seerumia käyttämällä useita aineita, esim., IL-IB: n, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, retinoidihapon johdannaiset tai aktiivisia happiradikaaleja. Tutkia sen korjaus rustovaurion indusoi liukoinen tulehduksellisten välittäjäaineiden (H 2 O 2, IL-1, TNF-a) tai fyysinen repeämä matriisin.
Organotyyppisten viljelmien menetelmä on malli eristettyjen ulkoisten tekijöiden in vitro -vaikutusten tutkimiseksi kondrosyytteihin ja ympäröivään matriisiin. In vivo kondrosyytit sijaitsevat harvoin ECM: ssä eivätkä kosketa toisiaan. Kiveksen rintakehän viljelmä säilyttää tämän rakenteellisen organisoinnin sekä erityiset vuorovaikutukset kondrosyyttien ja ympäröivän ekstrasellulaarisen ympäristön välillä. Tätä mallia tutkitaan myös mekaanisen rasituksen, farmakologisten aineiden, kasvutekijöiden, sytokiinien ja hormonien vaikutuksesta ruston metaboliaan.
Toinen rasvakudoksen eksplantaation etu on kondrottisen vaurion puuttuminen proteolyyttisillä entsyymeillä tai mekaanisella tekijällä, joka on väistämätön, kun solut eristetään. Receptorit ja muut kalvoproteiinit ja glykoproteiineja suojataan haitallisilta tekijöiltä.
Kondronien kulttuuri
Hondron - rakenteellisten, toiminnallisten ja metabolinen nivelruston, joka koostuu kondrosyyttien perisellulaarinen matriisi ja sen pienikokoinen hehkulanka kapseli ja on vastuussa homeostaasin matriisin. Kondroneja puretaan mekaanisesti rustosta ja kerätään useilla peräkkäisillä pienen nopeuden homogenisaatioilla. Eristetty vyöhykkeet eri syvyyksistä hondrony rusto voidaan jakaa neljään ryhmään: yksi hondron, kahden hondrony, useita (kolme tai enemmän) on järjestetty lineaarisesti hondrony (sarake hondronov) hondronov ruuhkia.
Yksittäiset kondrudit löytyvät tavallisesti kesken rintamaisen keskikerroksen, jotka ovat keskenään ja syvissä kerroksissa rajoittuneet, lineaarisesti sijoitetut useat kerrokset ovat tyypillisiä syvien rustojen syville kerroksille. Lopuksi kondronien ryhmät koostuvat satunnaisesti järjestetyistä yksittäisten ja pariksi muodostettujen ryhmien ryhmistä, jotka säilyttävät aggregoituneen tilan homogenoinnin jälkeen. Kondronien kertymät ovat suuria rustonosia, jotka yleensä sisältävät useita kondiineja ja säteittäisesti sijoitettuja kollageenifibrilejä eli tyypillistä organisaatiota, joka on ominaista matriisin syvistä kerroksista. Chondronit immobilisoidaan läpinäkyvään agaroosiin, mikä mahdollistaa niiden rakenteen, molekyylikoostumuksen ja aineenvaihdunnan toiminnan tutkimisen. Hondron järjestelmä - agaroosia pidetään mikro malli ruston, joka on erilainen kuin perinteinen järjestelmä, kondrosyyttien - agaroosia, joka säilyttää luonnollisen mikroympäristön, ei ole tarpeen suorittaa sen synteesiä ja kokoonpano. Kondronien kulttuuri on malli solujen ja matriisin vuorovaikutusten tutkimiseksi nivelrustossa normaaleissa ja patologisissa oloissa.
[31], [32], [33], [34], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41]
Kuolemattomien kondrosyyttien kulttuuri
Pysyvien solulinjojen muodostamiseksi käytetään rekombinantti-DNA: ta tai onkogeenia sisältäviä viruksia, jotka voivat tehdä solun "kuolemattomaksi". Kuolemattomilla kondrosyytteillä on mahdollisuus loputtomiin proliferaatioihin, säilyttäen stabiilin fenotyypin. F. Mallein-Gerin et ai (1995) osoittivat, että onkogeeni on SV40: n T-indusoitua proliferaatiota hiiren kondrosyyttien joka siten edelleen ilmentävät stabiilisti kollageenien II, IX ja XI tyyppejä, sekä yhteiset ja aggrekaania sitova proteiini. Tällainen solulinja saa kuitenkin kyvyn syntetisoida tyypin I kollageenia, kun sitä viljellään yksikerroksisessa viljelmässä tai agaroosigeelissä.
W. Horton ja kirjailijat (1988) kuvaavat rivin kuolemattomia soluja, joilla on alhainen kollageenityyppisen II mRNA-ilmentymisen taso. Nämä solut saatiin transformoimalla ne hiiren retroviruksella, joka sisälsi I-myc- ja y-ra-onkogeenejä. Tämäntyyppiset solut ovat ainutlaatuinen malli, jolla tutkitaan nivelmatriisin vuorovaikutusta tyypin II kollageenin puuttuessa, ja tyypin II kollageenin synteesin säätely.
Kondropyyttien viljelmä, jossa on mutatoituja tai poistettuja geenejä, on kätevä malli niiden fysiologisen toiminnan tutkimiseen. Tämä malli sopii erityisesti tutkimuksiin, jotka koskevat tiettyjä molekyylien rustomatriksissa järjestöjen tai Tutkittaessa erilaisten sääntelyyn tekijöiden rustometabolian. Kondrosyyttien kauko-geeni syntetisoitiin kollageenin tyyppi IX kollageenisäikeiden normaalia leveämpi, mikä osoittaa, että kollageenin tyyppi IX säätelee halkaisija fibrillien. Kuten I luvussa todettiin 1, vastikään löydetyn geenin mutaatio COLAI joka koodaa tyypin II kollageenia perheissä, joilla on primaarinen yleistynyt nivelrikko. Vaikutuksen tutkimiseksi mutantti II-tyypin kollageenia, että nivelen matriisin R. Dharmrvaram et ai (1997), joka suoritetaan transfektio ( "saastuminen" vieraan nukleiinihapposekvenssin) viallinen COL 2 AI (arginiini asemassa 519 on korvattu kysteiinillä) ihmisen sikiön rustosolujen in vitro.
Yhteiskulttuurijärjestelmä. Yhdessä rustossa on vuorovaikutuksessa muiden tyyppisten solujen kanssa synovial membraaniin, synovial nesteeseen, ligamentteihin, subchondral luu. Chondrosyyttien aineenvaihduntaan voivat vaikuttaa erilaiset liukoiset tekijät, joita nämä solut syntetisoivat. Joten, niveltulehduksen nivelrusto tuhoaa proteolyyttiset entsyymit ja vapaat radikaalit, joita synoviasolut tuottavat. Siksi on kehitetty malleja, joilla tutkitaan rustojen ja ympäröivien kudosten välisiä monimutkaisia vuorovaikutuksia, joita kutsutaan kulttuuriksi.
S. Lacombe-Gleise et ai (1995) viljeltiin kanin kondrosyyttien ja osteoblastien yhteisviljelmäjärjestelmässä (COSTAR), jossa solut erotettiin mikrohuokoisen kalvon (0,4 mikronia) voidaan vaihtaa kahden solutyyppien ilman suoraa kosketusta. Tämä tutkimus osoitti osteoblastien kyvyn stimuloida kondrosyyttien kasvua liukoisten välittäjien kautta.
AM Malfait ja tekijät (1994) tutkivat perifeerisen veren ja kondrosyyttien monosyyttien välistä suhdetta. Tämä malli on käyttökelpoinen tutkittaessa medioimissa sytokiinien tulehdukselliset nivelsairaudet (nivelreuma, seronegatiiviset spondyliitti et ai.). Mallin tekijät erotivat solut proteiinia sitovalla membraanilla ja huokoset olivat läpimitaltaan 0,4 um. Tutkimuksessa todettiin, että lipopolysakkaridin stimuloimaa monosyyttien työstetty iFNO IL-1-a, joka estää synteesin kondrosyyttien aggrekaanin ja osaltaan hajoaminen jo syntetisoitiin aggrekaania aggregaatteja.
K. Tada et ai (1994) luotiin yhteisviljelmää malli, jossa endoteelisolut kollageeni (I-tyyppi) geeli laitettiin sisäkammioon ulkokammiosta erotettuna kondrosyyttien sijoitettu suodatin, jonka huokoskoko on 0,4 mikronia. Kun ulkoinen kammio oli täysin eristetty, ihmisen endoteelisolut muodostivat putket kollageenigeelissä EGF: n tai TGF-a: n läsnä ollessa. Molempien TGF-solujen samanaikaisen viljelemisen myötä putkien riippuvainen muodostuminen endoteelisoluilla estettiin. Tämän prosessin kondrosyyttien esto estettiin osittain anti-TGF-beeta-vasta-aineilla. Voidaan olettaa, että kondrosyyttien tuottama TGF-beeta heikentää rustin vaskularisoitumista.
S. Groot ja tekijät (1994) kasvattivat samanaikaisesti 16-päivän vanhan sikiön hiiren hypertrofisia ja proliferatiivisia alueita aivokudoksen palasista. 4 päivän viljelyn jälkeen havaittiin kondrosyyttien transdifferentiaatiota osteoblasteihin ja osteoidimuodostuksen alkaminen. 11 päivän viljelyn jälkeen osa rustosta korvattiin luukudoksella ja luun matriisi osittain kalsifioitiin. Jotkut aivokudoksen tuottamat neuropeptidit ja hermovälittäjäaineet vaikuttavat osteoblastien metaboliaan tai niillä on reseptoreita. Niistä voidaan eristää norepinefriini, vasoaktiivinen suolen peptidi, kalsitoniinigeeniin liittyvä peptidi, aine P ja somatostatiini. Kondrosyytteillä viljeltynä aivokudoksen palaset voivat tuottaa joitain näistä tekijöistä, jotka voivat aiheuttaa kondrosyyttien transdifferentiaation prosessin osteoblasteihin.
[42], [43], [44], [45], [46], [47], [48], [49]
Ulkoisten tekijöiden vaikutus kondrosyyttien kulttuuriin
Hapenkestävyyden vaikutus kondrosyyttien aineenvaihduntaan
Useimmissa tapauksissa kondrosyyttiviljelmät kehittyvät ilmakehän hapenkestävyyden olosuhteissa. Kuitenkin on hyvin tiedossa, että in vivo -kondrosit ovat hypoksisissa olosuhteissa ja hapen jännitys vaihtelee erilaisten patologisten tilojen välillä. Kypsytysprosessin aikana havaitaan merkittäviä muutoksia epifyysien verenkierrossa. Koska vaskularisaatio vaihtelee kasvatuslevyn eri alueilla, niiden hapenkestävyys vaihtelee myös. C. Brighton ja R. Heppenstall (1971) osoittivat, että kaniineissa sääriluun levylle hapen jännitys hypertrofisella vyöhykkeellä on pienempi kuin ympäröivässä rustossa. Joidenkin metabolisten parametrien mittaukset ovat osoittaneet, että kondrosyytit pystyvät reagoimaan nopeasti paikallisiin muutoksiin happipitoisuudessa. Ensinnäkin alhaisen hapenkestävyyden vuoksi sen kondrosyyttien kulutus vähenee. Kun hapen kiristys laskee 21 prosentista 0,04 prosenttiin, glukoosin käyttö lisääntyy, glykolyysin entsyymiaktiivisuus ja maitohapon synteesi lisääntyvät. Vaikka alhainen hapenkestävyys myös, ATP: n, ADP: n ja AMP: n absoluuttinen määrä pysyy vakaana. Nämä tiedot osoittavat kondrosyyttien aineenvaihdunnan suunnan energiansäästön maksimoimiseksi. Kuitenkin synteettinen aktiivisuus ja siten parannusprosessit muuttuvat hypoksiaolosuhteissa.
Korkea hapenkestävyys vaikuttaa myös kondrosyyttien aineenvaihduntaan, mikä aiheuttaa proteoglykaanien ja DNA: n synteesin vähenemistä, ruston matriisin hajoamista. Näihin vaikutuksiin liittyy yleensä vapaa happiradikaalien tuottaminen.
Ionipitoisuuden ja osmoottisen paineen vaikutus kondrosyyttien toimintaan
Natiivi rusto-ionin konsentraatio on merkittävästi erilainen kuin muut kudokset: natriumpitoisuus solunulkoisessa väliaineessa on 250-350 mmol, ja sen osmolaarisuus - 350-450 mOsm. Kun eristetään kondrosyytit videonauhurin ja niitä inkuboitiin standardin media (DMEM (Dulbeccon Minimal Essential Medium - Dulbeccon Minimum Essential Medium) osmolaarisuus - 250-280,7 mOsm) muuttuu jyrkästi ympäröivän solun ympäristöä. Lisäksi kalsiumin ja kaliumin pitoisuus vakiotyypeissä on paljon pienempi kuin alkuperäisessä kudoksessa, ja anionien pitoisuus on paljon suurempi.
Lisäämällä sakkaroosia väliaine johtaa sen osmolaarisuuden suurentamiseksi ja aiheuttaa ohimenevää pitoisuuden kasvu solunsisäisen H + ja anionit kalsiumin sytosolissa. Tällaiset solunsisäiset muutokset voivat vaikuttaa kondrosyyttien erilaistumisen prosesseihin ja niiden metaboliseen aktiivisuuteen. J. Urban et ai (1993) havaitsi, että sisällyttäminen 35 8-sulfaatti ja 3 H-proliini eristetty kondrosyytit inkuboitiin DMEM standardi väliaineessa 2-4 tuntia, oli vain 10%, että luontaisen kudoksen. Synteesi intensiteetti oli korkeimmillaan kun osmolaarisuus ekstrasellulaarisesta väliaineesta 350-400 mOsm hiljattain eristetty kondrosyyteissä ja rustoeksplantaateista sisään. Lisäksi kondrosyyttien tilavuus kasvoi 30-40% sen jälkeen, kun eristetyt solut oli sijoitettu mainitun osmolaarisuuden standardiin DMEM-väliaineeseen. Kuitenkin, kun sitä viljellään kondrosyyttien ei-fysiologisissa osmolaarisuus on 12-16 tuntia, solut sovitettu uuteen ympäristöön vähentämällä intensiteetti leikkausvoiman on verrannollinen biosynteesin osmolaarisuus ekstrasellulaariseen väliaineeseen.
P. Borgetti ym (1995) tutki vaikutusta osmolariteetista solunulkoiseen kasvuun, morfologia ja biosynteesiä sian rustosolujen. Kirjoittajat osoittivat, samanlaisia biokemiallisia ja morfologisia ominaisuuksia kondrosyyttien viljeltiin väliaineessa, jossa on osmolaarisuus mOsm 0,28 ja 0,38. Kun 0,48 mOsm osmolaarisuutta ensimmäisen 4-6 tunnin viljelyn todettiin solujen lisääntymisen vähenemisen ja proteiinisynteesiä, mutta myöhemmin tapahtunut palauttaa nämä parametrit, jotka lopulta saavutti kontrolliarvoihin. Kun viljellään kondrosyyttien väliaineessa, jossa on 0,58 mOsm osmolaarisuus solut menettävät kykynsä tukea fysiologinen voimakkuus proliferatiiviset prosessit ja sen jälkeen 6 päivä määrä kondrosyyttien vähenee merkittävästi. Kun osmolaarisuus media, 0,58 mosmol, syvä estää proteiinisynteesiä. Lisäksi, kun niitä viljellään väliaineessa, jossa on osmolaarisuus mOsm 0,28-0,38 kondrosyyttien säilyttää fysiologinen fenotyyppi suurempi osmolaarisuus (mOsm 0,48-0,58) merkittävät muutokset solun morfologiassa, kuten ilmenevä viöominaisuuden fenotyyppi kondrosyyttien muuntaminen fibroblastien kaltaisiin soluihin, samoin kuin solujen häviämiseen, kykyä koota matriisin proteoglykaaneja. Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että kondrosyyttien kyky vastata rajoitettuihin osmolaliteettivärähtelyihin solunulkoisessa ympäristössä.
Muiden ionien pitoisuuden muutos voi myös vaikuttaa biosynteesin prosesseihin kondrosyytteihin. Näin ollen 35 S: n (sulfaatti) lisäysaste kasvaa puoleen kasvattamalla kaliumionien konsentraatiota 5 mmol: sta (pitoisuus standardi DM DM-väliaineessa) 10 mmol: aan (konsentraatio VKM in vivo). Kalsiumin pitoisuus alle 0,5 mmol vaikutti kollageenin tuottamiseen kypsillä sonnien kondrosyytteillä, kun taas konsentraatio 1-2 mmol (vastaa pitoisuutta standardi DM DM -väliaineessa) aiheutti merkittävän vähenemisen kollageenisynteesissä. Biosynteesin kohtalainen nousu havaittiin suurilla kalsiumpitoisuuksilla (2-10 mmol). Erilaiset kationit osallistuvat kondrosyyttien kiinnittymiseen VKM-proteiineihin. Täten magnesium- ja mangaani-ionit liittävät fibronektiiniin ja kollageenityyppiin II, kun taas kalsiumioniet eivät osallistu kondrosyyttien kiinnittymiseen proteiineihin. Siten kuvattujen tutkimusten tulokset osoittavat, että mediaan kaliumin, natriumin, kalsiumin ja osmolaarisuuden solunulkoisten ionien muutokset vaikuttavat vakiomedioon inkuboidun kondrosyyttien biosynteettiseen funktioon.
Mekaanisen stressin vaikutus kondrosyyttien aineenvaihduntaan
Kiinnityksen immobilisointi aiheuttaa ruston kääntyvän atrofian, mikä osoittaa mekaanisten ärsykkeiden tarvetta metabolisen prosessin normaalille kulkemiselle ECM: ssä. Useimmissa tapauksissa käytetyt soluviljelmämallit ovat normaaleissa ilmakehän paineolosuhteissa. M. Wright ja tekijät (1996) osoittivat, että mekaaninen ympäristö vaikuttaa kondrosyyttien aineenvaihduntaan, solujen vaste riippuu puristuskuorman intensiteetistä ja taajuudesta. Kokeet, joissa on likaantunut koskemattomien nivelten rustojen eksplantaatiot in vitro, osoittivat proteiinien ja proteoglykaanien synteesin vähenemisen staattisen kuormituksen vaikutuksesta, kun taas dynaaminen lastaus stimuloi näitä prosesseja. Tarkka mekanismit mekaanisen kuorman vaikutuksia ruston monimutkainen, ja todennäköisesti liittyvät kanta soluja, hydrostaattinen paine, osmoottisen paineen, sähköinen potentiaali ja solun pinnan reseptorien matriisin molekyylejä. Jokaisen parametrin vaikutuksen tutkimiseksi on välttämätöntä luoda järjestelmä, jossa yksi parametri voi itsenäisesti vaihdella. Esimerkiksi eksanttikulttuuri ei sovi solujen muodonmuutoksen tutkimiseen, mutta sitä voidaan käyttää tutkimaan paineen kokonaisvaikutusta kondrosyyttien metaboliseen aktiivisuuteen. Puristus ruston johtaa solun muodonmuutosta, ja myös mukana esiintyminen hydrostaattinen paine kaltevuus, sähköpotentiaali, ja nesteen virtauksen muutos fysikaalis sellaisista tekijöistä, kuten vesipitoisuus matriisissa, tiheys sähkövaraus, taso osmoottisen paineen. Solun muodonmuutosta voidaan tutkia käyttäen eristettyjä kondrosyyttejä, jotka on upotettu agaroosiin tai kollageenigeeliin.
Monia järjestelmiä on kehitetty tutkimaan mekaanisen stimulaation vaikutusta kondrosyyttien viljelmään. Jotkin tutkijat käyttävät tähän tarkoitukseen käytettäviä järjestelmiä, joissa paine kohdistetaan soluviljelmään kaasufaasin kautta. Esimerkiksi JP Veldhuijzen et ai (1979) käyttäen ilmanpainetta korkeammassa 13 kPa pienellä taajuudella (0,3 Hz) 15 minuutin aikana, havaitsimme kohoamisen cAMP: n synteesiin ja proteoglykaanien ja alentamalla DNA-synteesiä. R. Smith et ai (1996) osoittivat, että ajoittainen altistuminen primääriviljelmien kondrosyyttien sonni hydrostaattinen paine (10 MPa) 1 Hz: ssa 4 tunnin ajan kasvun aiheuttanut synteesin aggrekaanin ja tyypin II kollageenia, kun taas jatkuva paine ei ollut mitään vaikutusta näihin prosesseihin. Käyttämällä samanlaista järjestelmää M. Wright et ai (1996) raportoivat, että syklinen paine soluviljelmän liittyy hyperpolarisaation solukalvon kondrosyyttien ja aktivaation Ca 2 + -riippuvaisen kaliumkanavia. Siten syklisen paineen vaikutukset välittyvät ionikanavilla, jotka aktivoituvat venyttämällä, kondrosyytti- kalvossa. Chondrosyyttien vaste hydrostaattiseen paineeseen riippuu soluviljelmän olosuhteista ja käytetyn kuormituksen taajuudesta. Siten, syklinen hydrostaattinen paine (5 MPa) vähentää sulfaatin liittymisen kondrosyyttien yksikerroksinen taajuudella 0,05, 0,25 ja 0,5 Hz, kun taas taajuudet yli 0,5 Hz sisällyttäminen päällä ruston eksplantaatilta kasvaa.
M. Bushmann et ai. (1992) raportoivat, että agaroosigeelissä olevat kondrosyytit muuttavat biosynteesiä vasteena staattiselle ja dynaamiselle mekaaniselle rasitukselle samalla tavoin kuin viljelty koskematon elin. Kirjoittajat havaitsivat, että mekaaninen kuormitus herättää hyperosmotista ärsykettä ja seuraa pH: n väheneminen kondrosyytteissä.
Mekaanisen venytyksen vaikutus voidaan tutkia geeliin upotettujen solujen viljelmässä. Venytysvoima voidaan luoda käyttämällä tietokoneohjattua tyhjiötä. Kun järjestelmä on tietty alipaine, pohja petrimaljan soluviljelmää jatkeena on tunnettu määrä, suurin muodonmuutos reunoilla kupin pohja ja vähintään keskellä. Venytys lähetetään ja viljellään kondrosyyttien petrimaljassa. Tämän menetelmän, Holm-vall K. Et ai (1995) osoittivat, että viljellään kollageenin (II tyyppi) geeli kondrosarkoomasoluissa lisäsi mRNA: n ja 2 -integrina. 2 p r integriini pystyy sitoutumaan tyypin II kollageenin. Sitä pidetään mekoneceptorina, koska se vuorovaikuttaa aktiinin sitovien proteiinien kanssa, jolloin se yhdistää ECM: n ja sytoskeletonin.
PH: n vaikutus kondrosyyttien aineenvaihduntaan
Kartongin kudoksen ECM: n välitilaveden pH on happamampi kuin muissa kudoksissa. A. Maroudas (1980) määritteli nivelruston pH: n 6,9. W. Diamant ja kirjoittajat (1966) löysivät pH-arvon 5,5 patologisissa olosuhteissa. Tiedetään, että kondrosyytit elävät alhaisella PO2: lla, mikä osoittaa glykolyysin tärkeän roolin (95% kokonaisglukoosin metabolian) näiden solujen metaboliaan; glykolyysiin liittyy suuri määrä maitohappoa.
Glykolyysin tuotteiden happamoitumisen lisäksi matriisikomponentit itse ovat erittäin tärkeitä. Suuri määrä kiinteitä negatiivista varausta solunulkoiseen proteoglykaanien muutetaan ioni- koostumus: on korkea pitoisuus vapaiden kationien (esim. H +, Na +, K + ) ja alhainen pitoisuus anionien (esim., O2, NPHS). Lisäksi mekaanisen kuormituksen vaikutuksesta vesi poistuu ECM: stä, mikä johtaa kiinteiden negatiivisten varausten pitoisuuden kasvuun ja kationien vetämiseen matriisiin. Tämän seurauksena solunulkoisen alustan pH: n lasku, joka vaikuttaa solunsisäiseen pH: hon, muuttaen siten kondrosyyttien aineenvaihduntaa. R. Wilkin ja A. Hall (1995) tutkivat solunulkoisen ja solunsisäisen elatusaineen pH: n vaikutusta matriisin biosynteesiin eristettyjen bull-kondrosyyttien vaikutuksesta. He havaitsivat kaksoismodifikaation matriisien synteesin pH: n laskemisella. Pientä vähenemistä pH: n (7,4
[50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57]
Kasvatusalustan koostumuksen vaikutus kondrosyyttien aineenvaihduntaan
Kondrosyyttien viljelyalustan on vastattava kokeellisia olosuhteita. Viime vuosina vasikan seerumia on käytetty viljelyolosuhteiden optimoimiseen. Kun käytät seerumia, on kuitenkin otettava huomioon useita tärkeitä kohtia:
- solujen ulkoisen kasvun kudoksen kehältä urbaaniviljelmissä,
- erilaisten sarjojen seerumien koostumuksen vaihtelevuus,
- niiden tuntemattomien komponenttien läsnäolo,
- lisääntynyt interferenssiriski, esineitä tutkimalla eri biologisten tekijöiden vaikutusta solujen metaboliseen aktiivisuuteen.
Esimerkki jälkimmäisestä on EGF: n vaikutuksen tutkiminen rustokondrosyytteihin rotilla. EGF stimuloitu sisällyttäminen 3 H-tymidiiniä ja lisätä DNA-pitoisuus viljelmän. Tämä vaikutus oli voimakkaampi alhaisilla seerumin pitoisuuksilla (<1%), mutta suurilla pitoisuuksilla (> 7,5%) vaikutus häviää.
On hyvin tiedossa, että synteesi- ja hajoamistasot DMEM: ssä, joka on rikastettu vasikan seerumilla, lisääntyvät merkittävästi verrattuna in vivo -olosuhteisiin. Eroja in vivo ja in vitro -metabolian välillä voivat johtua synoviaalisen nesteen ja ympäristön välillä, jossa soluja viljellään. D. Lee et ai (1997) viljeltiin kondrosyyttien nuorten sonnien agaroosista käyttäen ravintoliuoksessa, joka sisälsi DMEM: ää, joka on rikastettu 20% vasikan seerumia, ja suuri määrä allogeenisten normaalin nivelnesteen. Synovial-nesteen läsnäolo väliaineessa indusoi proteoglykaanien määrän kasvua, jopa 80% synovial-nesteen kokonaismäärästä. Saadut tulokset viittaavat siihen, että synoviaalinen neste viljelyssä indusoi samanlaisen metabolisen nopeuden kuin in vivo, jolloin glykosaminoglykaaneilla on suuri synteesi ja alhainen solujako.
G. Verbruggen et ai (1995), osoitti, että synteesi 35 S-arrpeKaHa ihmisen kondrosyyttien viljeltiin agaroosi DMEM: ssä ilman seerumia oli 20-30%: n tason synteesin havaittiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% vasikan seerumia. Kirjoittajat määrittävät siinä määrin, että IGF-1, IGF-2, TGF-P: tä tai vähentää insuliinin tuotantoa aggrekaanin väliaineessa ilman seerumia. Tekijät päättelivät, että 100 ng / ml insuliinia, IGF-1 tai IGF-2: osittain alennetussa synteesi aggrekaanin on 39-53% kontrollista tasoilla. Näiden tekijöiden yhdistelmällä ei ole tunnistettu synergistisiä tai kumulatiivisia ilmiöitä. Samaan aikaan, 10 ng / ml TGF-P: n läsnä ollessa 100 ng / ml insuliinia stimuloitu synteesi aggrekaanin 90% tai enemmän viitetaso. Lopuksi, seerumin transferriini, yksinään tai yhdistelmänä insuliinin kanssa, ei vaikuttanut aggrekaanin synteesiin. Kun vasikan seerumi korvattiin naudan seerumialbumiinilla, aggregrektin aggregaattipitoisuus väheni merkittävästi. Rikastaminen elatusaineessa insuliinin, IGF, tai TGF-P palautti osittain solujen kykyä tuottaa aggrekaania aggregaatteja. Tässä tapauksessa IGF-1 ja insuliini pystyvät ylläpitämään homeostaasia soluviljelmissä. Jälkeen 40 päivä viljelyn väliaineessa, jota oli täydennetty 10-20 ng / ml IGF-1, proteoglykaanin synteesi pidettiin samalla tasolla tai jopa korkeampi verrattuna, joka sisälsi 20% vasikan seerumia. Katabolisia prosesseja eteni hitaasti väliaineessa, johon on IGF-1 kuin väliaineessa, jota oli täydennetty 0,1% albumiinia, mutta hieman nopeammin väliaineessa, jota oli täydennetty 20% seerumia. Pitkäkestoisissa viljelmissä 20 ng / ml IGF-1 ylläpitää stabiilia solujen tilaa.
D. Lee et ai (1993) vertasivat koostumuksen vaikutuksen viljelyväliainetta (DMEM, DMEM, + 20% vasikan seerumia DMEM + 20 ng / ml IGF-1), DNA-synteesin kulttuurin eksplantaatin ruston, yksikerrosviljelmä ja suspensiossa agaroosi . Kun niitä viljeltiin agaroosilla seerumin läsnä ollessa, kirjoittajat havaitsivat taipumuksen ryhmäsondrolaattien ryhmään suuriksi klustereiksi. Solut, joita kasvatettiin ilman seerumia ja IGF1, säilyttää ympyränmuotoinen agaroosi, kerättiin pienissä ryhmissä, mutta eivät muodosta suuria aggregaatteja. Yksikerroksisessa DNA-synteesi oli merkittävästi suurempi seerumia sisältävässä väliaineessa kuin väliaineessa, jota oli täydennetty IGF-1; DNA: n synteesi jälkimmäisessä oli paljon korkeampi kuin rikastumattomassa ympäristössä. Viljelemällä kondrosyyttejä suspensiossa agaroosia konsentroimaton väliaineessa ja väliaineessa, jossa on IGF-1, ei eroa DNA-synteesissä. Samalla lietteen viljellään kondrosyyttien agaroosia, joka oli täydennetty seerumin, liittyi lisääntynyt radionuklidin 3 H-tymidiiniä verrattuna muihin ympäristöihin.
C-vitamiini on välttämätön sellaisten entsyymien aktivoimiseksi, jotka osallistuvat kollageenin fibrillien stabiilin spiraalirakenteen muodostamiseen. Askorbiinihapolla puutteelliset kondrosyytit syntetisoivat hydroksyloituja, ei-heliksiä olevia kollageenin esiasteita, jotka hitaasti erittyvät. Askorbiinihapon (50 ug / ml) käyttöönotto aiheuttaa kollageenityyppien II ja IX hydroksylaatiota ja niiden erittymistä normaaleissa määrissä. C-vitamiinin lisääminen ei vaikuttanut proteoglykaanien synteesin tasoon. Tämän seurauksena kollageenin eritystä säätelevät itsenäisesti proteoglykaanien erittyminen.