Herpeksen diagnoosi

Herpesin diagnoosi perustuu klassiseen viruseristykseen herkissä soluviljelmissä, immunofluoresenssiin ja serologisiin menetelmiin, kolposkopiatutkimukseen sekä nykyaikaisten molekyylibiologisten menetelmien (PCR, dot hybridisation) käyttöön, joiden avulla voidaan diagnosoida koko herpesvirusryhmä, mukaan lukien HHV-6- ja HHV-7-tyypit.

Laboratoriomenetelmät herpesinfektion diagnostiikkaan

Tärkeimmät menetelmät HSV:n eristämiseksi tai viruspartikkelien ja/tai niiden komponenttien havaitsemiseksi	Apumenetelmät HSV-vasta-aineiden havaitsemiseksi ihmiskehon biologisissa nesteissä
HSV:n eristäminen herkissä solu- ja eläinviljelmissä Suora ja immuunielektronimikroskopia IPA:n suorat ja epäsuorat variantit IFA Molekyylibiologiset menetelmät Lateksin agglutinaatioreaktio	Neutralisaatioreaktio RSC HSV-1,2:n ei-rakenneproteiineihin kohdistuvien vasta-aineiden määritys

Osoitettiin, että 76 %:lla potilaista genitaaliherpes (GH) johtuu HSV-2:sta ja 24 %:lla HSV-1:stä. Lisäksi vain 22 %:lla potilaista GH esiintyi monoinfektiona, ja 78 %:lla tapauksista havaittiin mikrobien välisiä yhteyksiä. 46 %:lla henkilöistä havaittiin kahden patogeenin aiheuttama parasitokenoosi, mukaan lukien klamydia, jota havaittiin 40 %:lla tapauksista. Gardnerellaa, trikomonaseja ja gonokokkeja havaittiin harvemmin irtosolunäytteissä.

27 %:lla potilaista parasitocenoosia edusti kolme taudinaiheuttajaa, 5,2 %:lla neljä taudinaiheuttajaa. Lisäksi useimmiten havaittiin klamydian yhdistelmä gardnerella- ja Candida-sienten kanssa. Nämä tiedot tukevat GH-potilaiden perusteellisen bakteriologisen tutkimuksen tarvetta taudinaiheuttajien yhdistelmien tunnistamiseksi sekä perusteellista tutkimusta urogenitaalialueen sekainfektioiden patogeneesistä, mikä mahdollistaa herpesinfektion eriytetyn kompleksisen hoidon.

HSV:n eristämiseksi tutkitut materiaalit herpeettisten vaurioiden lokalisoinnista riippuen

Vaurioiden lokalisointi	Vesikkelin sisältö	Solujen kaavinta				Selkäydinneste	Keuhkoputkiaspiraatti	Biopsia	Veri
		1	2	3	4
Nahka	+								+
Silmät			+						+
Sukupuolielimet				+					+
Peräaukko	+				+				+
Suu	+	+							+
Keskushermosto	+					+		+	+
Keuhkot		+					+		+
Maksa								+	+
Synnynnäinen herpes	+	+	+				+		+

Sytomegalovirusinfektion laboratoriodiagnostiikan menetelmät

Menetelmät	Tulosten saamiseksi tarvittava aika	Muistiinpanoja
VIROLOGINEN
Elektronimikroskopia	3 tuntia	Ei kovin helposti saavutettavissa
Viruksen eristäminen soluviljelmässä (VCI)	4–20 päivää	Normaali, hidas
Varhaisen AG:n immunofluoresenssivärjäys monoklonaalisilla vasta-aineilla	6 tuntia	Vähemmän tarkka
SYTOLOGISET	2–3 tuntia	Vähemmän tarkka
SEROLOGINEN
RSC	2 päivää	Standardi
RGA	1 päivä	Työvoimavaltainen
RIUTTA	6 tuntia	Yksinkertainen, täsmällinen
NRIF	6 tuntia	Vaikea
RIMP	6 tuntia	Vaikea
ELISA (IgM, DO)	6 tuntia	Nopea, yksinkertainen
Immunoblotti	6 tuntia	Kallis
MOLEKYYLIBIOLOGINEN
MG	5–7 päivää	Kallis, työvoimavaltainen
PCR-testaus	3 tuntia	Kallis

Herpes zoster -viruksen diagnostiset menetelmät

Diagnostiset menetelmät	Laboratoriotekniikat
EPÄSUORA
Valinta	Kudosviljely, kanan alkiot, laboratorioeläimet, yhteisviljely permissiivisten solujen tai auttajavirusten kanssa
Isolaattien tunnistaminen	Neutralisaatioreaktio, RSC, IF, PIEF, isolaattien saostumisreaktio, agglutinaatio, IF
SUORAAN
Sytologia	Sivelynäytteet: värillinen immunofluoresenssi
Histologia	Solun patomorfologia
Rakenne	Alkiomikroskopia, immunoelektronimikroskopia
Antigeenien määrittäminen	JOS, PIEF, RIM, IFA
Paikallisen vasta-ainetuotannon määrittäminen	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Molekyylibiologiset lähestymistavat	Molekyylihybridisaatio, PCR

Herpes zoster -viruksen aiheuttaman infektion laboratoriodiagnostiikka

Diagnostiset ongelmat	Menetelmät	Odotetut tulokset
Akuutti primaarinen infektio	1	Havaitseminen 2 tunnissa
	2	Vasta-ainetasot nousevat hitaasti
	3	Ilmenee 3 päivää tartunnan jälkeen
Akuutti uudelleen aktivoitunut infektio	1	UUU-bakteerien havaitseminen 2 tunnin kuluttua
	2	Vasta-ainetasot nousevat hitaasti
	4	Läsnä 4 päivää ihottuman ilmaantumisen jälkeen

1. VEGF-vesikkelien määritys nesteessä;
2. serologia: CSC, ELISA, havaitsemiseen tähtäävä
3. serologia: ELISA IgM:n havaitsemiseksi;
4. serologia: ELISA IgA:n ja IgM:n havaitsemiseksi.

Menetelmät herpes zoster -virusinfektion immuunivasteen osoittamiseksi

Lähestyä	Menetelmä
Vasta-ainetiitterin nousun havaitseminen toisessa seerumissa	RSK, RTGA, RPGA, IF-neutralisaatioreaktio, RIM, ELISA
Ig G- ja Ig A -luokkaspesifisten vasta-aineiden havaitseminen ensimmäisessä seeruminäytteessä	ELISA, IF, RIM, lateksiagglutinaatio

Potilaiden seeruminäytteiden herpesvirusinfektioiden serologisen tutkimuksen (ELISA) tulosten tulkinta

Infektion/markkerin nimi	Infektioiden keskimääräiset kynnysarvot
	Analyysin tulokset	Tulkinta
Sytomegalia Anti-CMV IgG (1-20 U/ml) CMV-vasta-aineet (100–300 %)	Positiivinen 1–6 Positiivinen 6–10 Positiivinen >10 Negatiivinen Positiivinen 100–300 Negatiivinen <90 Epävarma 90–100	Remissio Taudin pahenemisvaihe Taudin akuutti vaihe Ei infektiota (sairautta) Taudin akuutti vaihe Toista analyysi 2–3 viikon kuluttua
Herpes simplex 1,2 serotyyppiä Anti-HSV 1/2 yhteensä (100–900 %)	Positiivinen 100–400 Positiivinen 400–800 Positiivinen >800 Negatiivinen <100	Remissio Taudin pahenemisvaihe Taudin akuutti vaihe Ei infektiota (sairautta)

Taulukossa esitetään herpesvirusinfektioiden laboratoriodiagnostiikan tärkeimmät menetelmät sekä suositellut biologiset materiaalit, joita tutkitaan HSV:n eristämisessä ottaen huomioon herpeettisten vaurioiden lokalisointi.

Herpes simplex- ja CMV-virusten luotettava eristäminen herkkien soluviljelmien infektoimalla. Niinpä 26 potilaan virologisessa tutkimuksessa relapsivaiheen aikana HSV eristettiin herkästä Vero-soluviljelmästä 23 tapauksessa (88,4 %). Infektoiduissa viljelmissä havaittiin HSV:lle tyypillinen sytopaattinen vaikutus - monitumaisten jättisolujen muodostuminen tai pyöreiden ja suurentuneiden solujen kertyminen klustereiden muodossa. 52,1 %:ssa tapauksista viruksen sytopaattisen vaikutuksen pesäkkeitä voitiin havaita jo 16–24 tuntia infektion jälkeen. Infektoituneiden viljelmien 48–72 tunnin inkuboinnin jälkeen solujen spesifistä tuhoa aiheuttavien materiaalien prosenttiosuus nousi 87 %:iin. Ja vain 13 %:ssa tapauksista havaittiin positiivisia tuloksia 96 tuntia infektion jälkeen tai myöhemmin tai toistuvien siirrostusten aikana.

Yleistyneen herpesinfektion laboratoriodiagnostiikkamenetelmät

Tärkeimmät menetelmät herpesvirusten, niiden hiukkasten ja komponenttien havaitsemiseksi (eristämiseksi)	Apumenetelmät herpesvirusten vasta-aineiden havaitsemiseksi biologisissa nesteissä, entsymaattisten muutosten havaitsemiseksi veriseerumissa
Herpesvirusten eristäminen herkistä solu- ja eläinviljelmistä Suora ja immuunielektronimikroskopia Immunoperoksidaasimenetelmän suorat ja epäsuorat variantit Fluoresoivan vasta-aineen menetelmän suorat ja epäsuorat variantit Kiinteän faasin entsyymi-immunomäärityksen variantit Molekyyli- (DNA-DNA) hybridisaatiomenetelmän variantit Polymeraasiketjureaktio Lateksiagglutinaatioreaktio	Neutralisaatiokoe Komplementin sitoutumistesti Lateksiagglutinaatiokoe Fluoresoivan vasta-aineen menetelmän epäsuora versio Immunoperoksidaasimenetelmän epäsuora versio Kiinteän faasin entsyymi-immunomäärityksen variantit Immunoblotting-menetelmä Radiaalinen komplementin sitoutumismenetelmä Alaniini- ja aspartaattiaminotransferaasitasojen määritys

Tarttuvan mononukleoosin (EBV:n aiheuttaman infektion) diagnosointiin käytetään serologisia menetelmiä. Paul-Bunnellin reaktio pässin punasoluilla, diagnostinen tiitteri 1:28 tai korkeampi yksittäisessä veriseerumitestissä tai vasta-aineiden nelinkertainen nousu paritettuja seerumeita tutkittaessa. Käytetään Hoff-Bauerin reaktiota 4-prosenttisella formalinisoitujen hevosen punasolujen suspensiolla. Tulos otetaan huomioon 2 minuutin kuluttua; tarttuvassa mononukleoosissa reaktio on erittäin spesifinen.

Tällä hetkellä kehitetään entsyymi-immunomääritysmenetelmää (EIA) tarttuvan mononukleoosin diagnosoimiseksi. Tässä tapauksessa potilaan seerumin IgG- ja IgM-vasta-aineet määritetään inkuboimalla sitä EBV-tartunnan saaneiden lymfoblastien kanssa, minkä jälkeen käsitellään fluoresoivilla vasta-aineilla. Taudin akuutissa vaiheessa viruksen kapsidiantigeenin vasta-aineet määritetään tiitterissä 1:160 ja korkeammassa suhteessa.

Useita maahantuotuja kaupallisia testijärjestelmiä käytettäessä ELISA voi havaita: vasta-aineita EBV-vaippavasta-aineita vastaan, vasta-aineita EBV:n varhaiselle antigeenille, kokonaisvasta-aineita EBV:n varhaiselle antigeenille, jotka määritetään taudin akuutissa vaiheessa sekä ytimessä että solun sytoplasmassa, ja rajoitettuja vasta-aineita EBV:n varhaiselle antigeenille, jotka määritetään taudin akuutissa vaiheessa sekä ytimessä että solun sytoplasmassa, rajoitettuja vasta-aineita EBV:n varhaiselle antigeenille, jotka määritetään taudin huipulla vain solun sytoplasmassa, ja vasta-aineita EBV:n ydinantigeenille. Näiden testijärjestelmien käyttö mahdollistaa useiden EBV:hen liittyvien sairauksien erotusdiagnostiikan.

Positiivisen ELISA-testin jälkeen, joka paljastaa EBV-vasta-aineet, suoritetaan vahvistava immunoblottausreaktio, joka määrittää vasta-aineiden läsnäolon yksittäisille EBV-markkeriproteiineille (p-proteiineille): p23, p54, p72 (tämän proteiinin läsnäolo osoittaa EBV:n lisääntymismahdollisuuden), p 138. Edellä mainittuja laboratoriomenetelmiä käytetään myös hoidon tehokkuuden seurantaan.

Virologisten menetelmien herkkyys on 85–100 %, spesifisyys 100 % ja tutkimusaika 2–5 päivää. Käytännössä käytetään usein suoraa immunofluoresenssimenetelmää (DIF), jossa käytetään polyklonaalisia tai monoklonaalisia vasta-aineita HSV-1:tä ja HSV-2:ta vastaan. DIF-menetelmä on melko helposti toistettavissa tavallisessa kliinisessä laboratoriossa, se ei ole kallis, herkkyys on yli 80 % ja spesifisyys 90–95 %. Immunofluoresenssimikroskopia paljasti sytoplasmisten inkluusioiden esiintymisen, morfologiset piirteet ja infektoituneiden solujen prosenttiosuuden virtsaputken, kohdunkaulan kanavan, kohdunkaulan ja peräsuolen irtosolunäytteistä ja kaapimista.

PIF-menetelmä antaa kuvan solujen morfologisista ominaisuuksista ja HSV-antigeenien lokalisaation muutoksista. Herpesvirusten aiheuttamien suorien soluvaurioiden merkkien (spesifisen luminesenssin havaitseminen) lisäksi PIF-tietojen mukaan on olemassa epäsuoria herpesinfektion merkkejä:

• ydinaineen aggregaatio, karyolemman irtoaminen;
• niin kutsuttujen "reikä"-ytimien läsnäolo, kun solun ytimestä on jäljellä vain yksi karyolemma;
• intranukleaaristen sulkeumien läsnäolo - Cowdry-kappaleet.

Suorittaessaan PIF-tutkimusta lääkäri saa paitsi kvalitatiivisen myös kvantitatiivisen arvion infektoituneiden solujen tilasta, jota käytimme asykloviiri-antiviraalisen hoidon (AC) tehokkuuden arviointiin. Näin ollen 80 yksinkertaista genitaaliherpestä (GH) sairastavaa potilasta tutkittiin PIF-menetelmällä dynamiikassa. Osoitettiin, että jos ennen asykloviirihoitoa 88 %:lla potilaista oli korkea infektoituneiden solujen prosenttiosuus (50–75 % ja enemmän) irtosolunäytteissä, niin yhden asykloviirihoidon jälkeen terveitä soluja havaittiin 44 %:lla potilaista, 31 %:lla tapauksista havaittiin yksittäisiä infektoituneita soluja ja 25 %:lla potilaista infektoituneita soluja oli jopa 10 %.

Infektoituneiden solujen pitoisuus asikloviirihoitoa saaneiden genitaaliherpespotilaiden irtosolunäytteissä (PIF-reaktio)

Sairausjaksot	Prosenttiosuus tahranäytteissä
	Tartunnan saaneet solut					Normaalit solut
	Yli 75 %	50–75 %	40–50 %	10 %	Yksittäiset solut näkökentässä
Retkahdus (ennen hoitoa)	25 %	63 %	12 %
	(20)	(50)	(10)
Remissio (hoidon jälkeen)				25 %	31 %	44 %
				(20)	(25)	(35)

Käytettäessä PIF:ää ja pistehybridisaatiomenetelmää useiden vuosien ajan on havaittu, että tutkimuksen tulokset ovat lähes 100 %:ssa tapauksista yhteneväisiä. On huomattava, että herpes-diagnoosin luotettavuuden lisäämiseksi, erityisesti subkliinisissä ja matalan ilmentymän herpes-muodoissa, on suositeltavaa käyttää työssä 2-3 laboratoriodiagnostiikkamenetelmää, erityisesti tutkittaessa raskaana olevia naisia, naisia, joilla on epäsuotuisa synnytyshistoria, ja henkilöitä, joilla on määrittelemätön gynekologinen diagnoosi.

Näin ollen urogenitaalialueen virus- ja bakteeri-infektioiden PCR-diagnostiikassa on tarpeen arvioida saadut positiiviset tulokset ottaen huomioon anamneesi ja taudin spesifisten kliinisten oireiden esiintyminen (tai puuttuminen). Jos klamydia havaitaan PCR:llä, infektion todennäköisyys on suuri ja hoitokysymykset voidaan ratkaista sen mukaisesti. Jos havaitaan mykoplasmoja (ureaplasmoja), jotka ovat opportunistisia mikro-organismeja, diagnoosin varmistamiseksi tarvitaan lisäviljelytutkimuksia, eli potilaalta kylvetään materiaalia herkkiin soluviljelmiin. Vain jos viljelyanalyysissä saadaan positiivisia tuloksia, voidaan puhua mykoplasmoosidiagnoosin laboratoriovahvistuksesta. Samalla menetelmällä voidaan tarvittaessa määrittää eristettyjen mykoplasmojen herkkyys usein käytetyille lääkemuodoille (antibiootit, fluorokinolonit jne.).

Samanaikainen infektio useilla Herpesviridae-heimon viruksilla on mahdollinen. Usein havaitsimme yhden potilaan infektion HSV-1-, HSV-2- ja CMV-viruksilla. Potilaat, joilla oli kliinisiä ja laboratoriokokeissa ilmentymiä sekundaarisesta infektoituneesta oireyhtymästä (onkohematologiset, onkologiset, HIV-tartunnan saaneet potilaat), saivat merkittävästi useammin tartunnan useilla herpesviruksilla. Siten on osoitettu, että HIV-infektiossa eteneviin kliinisiin ja immunologisiin häiriöihin liittyy molekyylihybridisaatiomenetelmällä havaittujen herpesvirusten määrän kasvu. Tässä tapauksessa prognostisesti merkittävimpänä voidaan pitää HSV-1-, CMV- ja HHV-6-tyyppisten DNA:iden monimutkaista samanaikaista havaitsemista.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]