Hyttyset, joilla on sisäänrakennettu "geneettinen kilpi", pysäyttävät malarian - tartuntaluvut laskevat 93%

Hyönteismyrkkyresistenssin voittaminen: Kuinka yksi geenimuokkaus hyttysissä lisääntyy itsestään sukupolvelta toiselle ja estää käytännössä malarian leviämisen vaarantamatta selviytymistä.

Äskettäin Nature -lehdessä julkaistussa tutkimuksessa tiedemiesryhmä selvitti, tekeekö fibrinogeeniin liittyvän proteiinin 1 (FREP1) glutamiini 224 (Q224) -alleeli Anopheles stephensi -hyttysistä vastustuskykyisiä Plasmodium-infektiolle, arvioi tähän alleeliin liittyviä selviytymiskustannuksia ja testasi alleeligeenijärjestelmää tämän suojaavan mutaation levittämiseksi populaatioihin.

Edellytykset

Noin 600 000 ihmistä kuoli malariaan vuonna 2023, enimmäkseen lapsia Saharan eteläpuolisessa Afrikassa ja Etelä-Aasiassa. Perinteiset torjuntamenetelmät – hyttysverkot, hyönteismyrkkykäsittelyt ja malarialääkkeet – ovat menettämässä tehoaan hyttysten ja loisten resistenssin vuoksi. Geeniteknologiat, jotka levittävät hyödyllisiä alleeleja hyttyspopulaatioihin, tarjoavat lupaavan ja kestävän ratkaisun.

FREP1-proteiini auttaa loisia läpäisemään hyttysen keskisuolen, mutta luonnollinen variantti Q224 voi estää tartunnan vaarantamatta hyttysen biologiaa. Tavoitteena oli testata, voitaisiinko tällaista endogeenistä alleelia levittää turvallisesti malarian leviämisen vähentämiseksi ja samalla hyttysen elinkelpoisuuden säilyttämiseksi.

Tietoja tutkimuksesta

CRISPR/Cas9-entsyymin avulla luotiin kaksi Anopheles stephensi -kantaa, jotka erosivat toisistaan vain FREP1-proteiinin 224. aminohapon osalta: villityyppi, jossa oli leusiinia (L224), ja mahdollisesti suojaava kanta, jossa oli glutamiinia (Q224). Ohjaus-RNA kohdistui intronialueeseen 126 bp kodonin ylävirtaan, mikä mahdollisti homologisen rekombinaation fluoresoivan leiman (GFP tai RFP) insertoinnilla.

Kunto arvioitiin siipien pituuden, hedelmällisyyden, munien kuoriutumiskyvyn, koteloitumisen, aikuisten esiinmarssin ja eliniän perusteella (Kaplan – Meier-selviytymisanalyysi).

Vektorikompetenssi määritettiin käyttämällä Plasmodium falciparum (ihminen) ja Plasmodium berghei (jyrsijä) -loisten standardikalvoruokintaa, ja sylkirauhasissa mitattiin ookystien ja sporotsoiittien määrä.

Alleeliohjausjärjestelmään kuului kasetti, jossa oli L224:ää ja Cas9:ää vastaan suunnattua gRNA:ta vasa-promoottorin säätelemässä tilassa. Alleelien frekvenssejä seurattiin fluoresoivien merkkien avulla monisyklisissä kokeissa (10 sukupolvea). Genotyypitys suoritettiin PCR:llä, Sanger-sekvensoinnilla ja NGS:llä. Bayes-mallinnus arvioi alleelin konversion, sopivuuskustannukset ja dynamiikan vapaan parittelun aikana laboratoriossa.

Tulokset

FREP1Q224-alleeli ei aiheuttanut merkittäviä menetyksiä eloonjäämisessä: siipien pituus, hedelmällisyys, kuoriutuminen, koteloituminen ja aikuiseksi ilmestyminen olivat identtiset FREP1L224-kontrollin kanssa. Pienet erot koiraiden koossa ja eliniässä eivät vaikuttaneet kilpailukykyyn. Neitsyt FREP1Q224-naaraat elivät yhtä kauan kuin kontrollit, ja verenruokinnan jälkeen naaraiden elinikä lyheni vain hieman.

Altistuskokeet paljastivat merkittävän suojan homotsygooteilla.

• Pienillä P. falciparum -gametosyyttipitoisuuksilla (0,08 %):
  • Infektioaste laski 80 prosentista ~30 prosenttiin FREP1Q224-tutkimuksessa;
  • Ookystien keskimääräinen lukumäärä: 3 - 0;
  • Sporotsoiitteja sylkirauhasissa: >4000 - 0.
• Korkeammalla gametosytemialla (0,15 %):
  • Ookystien keskimääräinen lukumäärä: ~32 -
  • Myös sporotsoiitit vähenivät dramaattisesti.
• P. bergheille:
  • Ookystien keskimääräinen lukumäärä: 43–25;
  • Sporotsoiitteja: ~19 000 - 11 000.
• Heterotsygootit (FREP1L224/Q224) eivät olleet suojattuja.

Geenien käyttötehokkuus

• Parillisissa risteytyksissä Cas9 + gRNA L224 muunsi 50–86 % FREP1L224-alleeleista FREP1Q224-alleeleiksi;
• Äidin Cas9:n kanssa esiintymistiheys oli korkeampi;
• Toisessa sukupolvessa suojaavan alleelin esiintyvyys oli 93 %;
• NHEJ-korjausreitin virheiden esiintyvyys oli alhainen (0–12 %) ja ne aiheuttivat tyypillisesti vaurioita.
• Solupopulaatioissa, joissa luovuttaja-vastaanottaja-suhde oli 1:3, FREP1Q224-frekvenssi nousi 25 prosentista > 90 prosenttiin 10 sukupolven aikana;
• NHEJ-alleelien esiintyvyys laski 5,4 prosentista

Bayes-mallinnus tuki hypoteesia korkeasta konversiosta, stabiilien mutaatioiden alhaisesta esiintymistiheydestä ja letaalista steriilistä mosaiikkisuusvaikutuksesta, jossa äidin Cas9-genotyypin omaavilla WT-homotsygooteilla esiintyi somaattisia mutaatioita ja heikompaa eloonjäämistä.

Myöhemmät sukupolvet osoittivat P. falciparum -ookystien lähes täydellisen tukahduttamisen (mediaani 0–5,5), mikä vahvisti, että populaatio oli tullut suurelta osin vastustuskykyiseksi loisten leviämiselle.

Suojaavalla alleelilla ei ollut piileviä hyötyjä tai sivuvaikutuksia, ja se levisi ajamisen kautta.

Johtopäätökset

Tutkimuksessa havaittiin, että yhden aminohapon korvaaminen FREP1-proteiinissa ja sen periytymisen muuttaminen geeniohjauksella voisi tehdä Anopheles stephensistä käytännössä immuunin malarialle – sekä ihmisille että jyrsijöille – vaarantamatta hyttysten elinkelpoisuutta.

Tämä lähestymistapa täydentää olemassa olevia toimenpiteitä (verkot, hyönteismyrkyt, lääkkeet), joiden tehokkuutta resistenssi heikentää. Tällaista järjestelmää voidaan käyttää myös hyönteismyrkkyjen herkkyyden palauttamiseen tai muiden suojaavien alleelien lisäämiseen.

Ennen kuin teknologia voidaan ottaa käyttöön, tarvitaan tiukat ympäristöön, etiikkaan ja hallintotapaan liittyvät kehykset sekä levityksen valvontajärjestelmät.