Keltarauhasen hematopoieettiset kantasolut

Hematopoieettisten kantasolujen erilaiset proliferatiiviset ja erilaistumispotentiaalit määräytyvät luonnollisesti niiden ontogeneettisen kehityksen erityispiirteiden mukaan, koska jopa hematopoieesin pääalueiden lokalisaatio muuttuu ihmisillä ontogeneesin aikana. Sikiön ruskuaispussin hematopoieettiset progenitorisolut sitoutuvat yksinomaan erytropoieettisen solulinjan muodostumiseen. Primaaristen HSC-solujen siirtymisen jälkeen maksaan ja pernaan sitoutumislinjojen kirjo laajenee näiden elinten mikroympäristössä. Erityisesti hematopoieettiset kantasolut saavat kyvyn tuottaa lymfoidisolulinjan soluja. Prenataalisella ajanjaksolla hematopoieettiset progenitorisolut saavuttavat lopullisen lokalisaatioalueen ja asuttavat luuytimen. Kohdunsisäisen kehityksen aikana sikiön veri sisältää merkittävän määrän hematopoieettisia kantasoluja. Esimerkiksi raskauden 13. viikolla HSC-taso saavuttaa 18% mononukleaaristen verisolujen kokonaismäärästä. Myöhemmin niiden pitoisuuden havaitaan asteittaista vähenemistä, mutta jo ennen syntymää HSC-solujen määrä napanuoraveressä eroaa vain vähän niiden määrästä luuytimessä.

Klassisten käsitteiden mukaan hematopoieesin lokalisaation luonnollinen muutos nisäkkäiden alkionkehityksen aikana tapahtuu migraation ja pluripotenttien hematopoieettisten kantasolujen tuonnin myötä uuteen mikroympäristöön - ruskuaispussista maksaan, pernaan ja luuytimeen. Koska alkionkehityksen alkuvaiheessa hematopoieettisessa kudoksessa on suuri määrä kantasoluja, joiden määrä vähenee sikiön kypsyessä, lupaavimpana hematopoieettisten kantasolujen saamiseksi pidetään alkion maksan hematopoieettista kudosta, joka on eristetty keskeytetystä materiaalista 5-8 raskausviikolla.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Kysymyksiä hematopoieettisten kantasolujen alkuperästä

Ei ole epäilystäkään siitä, että punasolujen alkionkehitys alkaa ruskuaispussin verisaarekkeista. Ruskuaispussin hematopoieettisten solujen erilaistumispotentiaali in vitro on kuitenkin hyvin rajallinen (ne erilaistuvat pääasiassa punasoluiksi). On huomattava, että ruskuaispussin hematopoieettisten kantasolujen siirto ei pysty palauttamaan hematopoieesia pitkään aikaan. Kävi ilmi, että nämä solut eivät ole aikuisten HSC-solujen esiasteita. Todelliset HSC-solut ilmestyvät aikaisemmin, kohdunsisäisen kehityksen 3.–5. viikolla, mahalaukun kudoksen ja verisuonten endoteelin muodostumisvyöhykkeelle (paraaorttinen splanchnopleura, P-SP), sekä aortan, sukurauhasten ja primaaristen munuaisten paikalle - mesonefrokseen eli niin kutsuttuun AGM-alueeseen. On osoitettu, että AGM-alueen solut ovat paitsi HSC-solujen, myös verisuonten endoteelisolujen sekä luukudoksen muodostumisprosesseihin osallistuvien osteoklastien lähde. Kuudennella raskausviikolla AGM-alueen varhaiset hematopoieettiset progenitorisolut siirtyvät maksaan, joka pysyy sikiön tärkeimpänä hematopoieettisena elimenä syntymään asti.

Koska tämä seikka on erittäin tärkeä solunsiirron kannalta, HSC-solujen alkuperäongelma ihmisen alkionkehitysprosessissa ansaitsee yksityiskohtaisemman esittelyn. Klassiset ajatukset nisäkkäiden ja lintujen hematopoieettisten kantasolujen alkuperästä alkion ulkopuolisesta lähteestä perustuvat Metcalfin ja Mooren tutkimuksiin, jotka käyttivät ensimmäisinä ruskuaispussista eristettyjen HSC-solujen ja niiden jälkeläisten kloonaamismenetelmiä. Heidän työnsä tulokset toimivat perustana migraatioteorialle, jonka mukaan ruskuaispussiin ensin ilmestyneet HSC-solut asuttavat peräkkäin väliaikaisia ja lopullisia hematopoieettisia elimiä vastaavan mikroympäristön muodostuessa niihin. Näin vahvistettiin näkökulma, jonka mukaan ruskuaispussiin alun perin paikallisten HSC-solujen muodostuminen toimii solupohjana lopulliselle hematopoieesille.

Ruskuaispussin hematopoieettiset progenitorisolut kuuluvat varhaisimpien hematopoieettisten progenitorisolujen luokkaan. Niiden fenotyyppiä kuvaa kaava AA4.1+CD34+c-kit+. Toisin kuin kypsät luuytimen HSC-solut, ne eivät ilmennä Sca-1-antigeenejä ja MHC-molekyylejä. Markkeriantigeenien esiintyminen ruskuaispussin HSC-solujen pintakalvoilla viljelyn aikana näyttää vastaavan niiden erilaistumista alkionkehityksen aikana sitoutuneiden hematopoieettisten linjojen muodostumiseksi: CD34- ja Thy-1-antigeenien ilmentymistaso laskee, CD38- ja CD45RA-ekspressio kasvaa ja HLA-DR-molekyylejä ilmestyy. Seuraavan sytokiinien ja kasvutekijöiden indusoiman in vitro -erikoistumisen myötä tietyn solulinjan hematopoieettisille progenitorisoluille spesifisten antigeenien ilmentyminen alkaa. Kolmen selkärankaisluokan (sammakkoeläimet, linnut ja nisäkkäät) edustajien alkion hematopoieesin tutkimustulokset ja erityisesti postnataalisessa ontogeneesissä lopullisesta hematopoieesista vastaavien HSC-solujen alkuperän analyysi ovat kuitenkin ristiriidassa klassisten käsitysten kanssa. On todettu, että kaikkien tarkasteltujen luokkien edustajilla muodostuu alkionkehityksen aikana kaksi itsenäistä aluetta, joilla HSC-solut syntyvät. Ekstraembryonista ”klassista” aluetta edustaa ruskuaispussi tai sen analogit, kun taas äskettäin tunnistettu HSC-solujen intraembryoninen lokalisaatiovyöhyke sisältää paraaorttisen mesenkyymin ja AGM-alueen. Nykyään voidaan väittää, että sammakkoeläimillä ja linnuilla definitiiviset HSC-solut ovat peräisin alkionsisäisistä lähteistä, kun taas nisäkkäillä ja ihmisillä ruskuaispussin HSC-solujen osallistumista definitiiviseen hematopoieesiin ei voida vielä täysin sulkea pois.

Ruskuaispussissa tapahtuva alkion hematopoieesi on itse asiassa primaarista erytropoieesia, jolle on ominaista tuman säilyminen punasolujen kypsymisen kaikissa vaiheissa ja sikiöhemoglobiinin synteesi. Uusimpien tietojen mukaan primaarisen erytropoieesin aalto päättyy ruskuaispussissa alkionkehityksen 8. päivänä. Tätä seuraa definitiivisten erytroidisten kantasolujen - BFU-E:n - kertymisjakso, jotka muodostuvat yksinomaan ruskuaispussissa ja ilmestyvät ensimmäisen kerran tiineyden 9. päivänä. Alkionkehityksen seuraavassa vaiheessa definitiiviset erytroidiset kantasolut - CFU-E:t - sekä (!) syöttösolut ja CFU-GM-solut ovat jo muodostuneet. Tämä on perustana näkemykselle, että definitiiviset kantasolut syntyvät ruskuaispussissa, kulkeutuvat verenkierron mukana, asettuvat maksaan ja käynnistävät nopeasti alkion sisäisen hematopoieesin ensimmäisen vaiheen. Näiden käsitteiden mukaan ruskuaispussia voidaan pitää toisaalta primaarisen erytropoieesin paikkana ja toisaalta alkionkehityksen ensimmäisenä hematopoieettisten kantasolujen lähteenä.

On osoitettu, että ruskuaispussista voidaan eristää jo kahdeksantena tiineyspäivänä, eli kauan ennen alkion ja ruskuaispussin verisuoniston sulkeutumista. Lisäksi ruskuaispussista in vitro saadut korkean proliferatiivisen potentiaalin omaavat solut muodostavat pesäkkeitä, joiden koko ja solukoostumus eivät eroa luuytimen kantasolujen viljelykasvun vastaavista parametreista. Samalla, kun ruskuaispussin korkean proliferatiivisen potentiaalin omaavia pesäkkeitä muodostavia soluja siirretään uudelleen, muodostuu huomattavasti enemmän tytärpesäkkeitä muodostavia soluja ja multipotentteja progenitorisoluja kuin käytettäessä hematopoieesin luuytimen progenitorisoluja.

Lopullinen johtopäätös ruskuaispussin hematopoieettisten kantasolujen roolista lopullisessa hematopoieesissa voidaan tehdä tutkimuksen tulosten perusteella, jossa kirjoittajat saivat ruskuaispussin endoteelisolujen linjan (G166), joka tuki tehokkaasti solujensa lisääntymistä HSC-solujen fenotyyppisillä ja toiminnallisilla ominaisuuksilla (AA4.1+WGA+, matala tiheys ja heikot adhesiiviset ominaisuudet). Jälkimmäisten pitoisuus kasvoi yli 100-kertaisesti, kun niitä viljeltiin C166-solujen syöttökerroksessa 8 päivän ajan. Makrofageja, granulosyyttejä, megakaryosyyttejä, blastisoluja ja monosyyttejä sekä B- ja T-lymfosyyttien esiasteita tunnistettiin C166-solujen alikerroksella kasvatetuista sekapesäkkeistä. Endoteelisolujen alikerroksella kasvavilla ruskuaispussisoluilla oli kyky lisääntyä itse, ja ne kestivät kirjoittajien kokeissa jopa kolme kulkua. Hematopoieesin palautuminen niiden avulla kypsillä hiirillä, joilla oli vaikea yhdistetty immuunipuutos (SCID), liittyi kaikenlaisten leukosyyttien sekä T- ja B-lymfosyyttien muodostumiseen. Tutkijat käyttivät kuitenkin tutkimuksissaan 10 päivän ikäisen alkion ruskuaispussisoluja, joissa alkion ulkopuoliset ja alkion sisäiset verisuonijärjestelmät ovat jo sulkeutuneet, mikä ei salli sulkea pois alkion sisäisten HSC-solujen esiintymistä ruskuaispussisolujen joukossa.

Samanaikaisesti analysoimalla varhaisessa kehitysvaiheessa olevien hematopoieettisten solujen erilaistumispotentiaalia, jotka oli eristetty ennen ruskuaispussin ja alkion verisuoniston yhdistymistä (8–8,5 päivää tiineyttä), havaittiin T- ja B-solujen esiasteita ruskuaispussissa, mutta ei alkion kehossa. In vitro -järjestelmässä, kaksivaiheisella viljelyllä kateenkorvan epiteeli- ja subepiteliaalisolujen yksikerroksisella kerroksella, ruskuaispussin mononukleaariset solut erilaistuivat pre-T- ja kypsiksi T-lymfosyyteiksi. Samoissa viljelyolosuhteissa, mutta maksan ja luuytimen stroomasolujen yksikerroksisella kerroksella, ruskuaispussin mononukleaariset solut erilaistuivat pre-B-soluiksi ja kypsiksi IglVT-B-lymfosyyteiksi.

Näiden tutkimusten tulokset osoittavat immuunijärjestelmän solujen kehittymisen mahdollisuuden ruskuaispussin alkion ulkopuolisesta kudoksesta, ja primaaristen T- ja B-solulinjojen muodostuminen riippuu alkion hematopoieettisten elinten strooman mikroympäristön tekijöistä.

Muut kirjoittajat ovat myös osoittaneet, että ruskuaispussi sisältää soluja, joilla on potentiaalia lymfoidisolujen erilaistumiseen, eivätkä syntyneet lymfosyytit eroa antigeenisten ominaisuuksien osalta sukupuolikypsien eläinten lymfosyytistä. On osoitettu, että 8–9 päivän ikäisen alkion ruskuaispussin solut kykenevät palauttamaan lymfopoeesin atymosyyttien kateenkorvaan, jolloin syntyy kypsiä CD3+CD4+- ja CD3+CD8+-lymfosyyttejä, joilla on muodostunut T-solureseptorien kokoelma. Näin ollen kateenkorva voi olla alkion ulkopuolista alkuperää olevien solujen asuttama, mutta on mahdotonta sulkea pois varhaisten T-lymfosyyttien esiasteiden todennäköistä siirtymistä alkionsisäisistä lymfopoeesin lähteistä kateenkorvaan.

Samaan aikaan ruskuaispussin hematopoieettisten solujen siirto aikuisille sädehoitoa saaneille vastaanottajille ei aina johda köyhtyneiden hematopoieettisten elinten pitkäaikaiseen uudelleenpopulaatioon, ja in vitro ruskuaispussin solut muodostavat huomattavasti vähemmän pernapesäkkeitä kuin AGM-alueen solut. Joissakin tapauksissa 9 päivän ikäisen alkion ruskuaispussin soluja käyttämällä on silti mahdollista saavuttaa pitkäaikainen (jopa 6 kuukautta) hematopoieettisen kudoksen uudelleenpopulaatio sädehoitoa saaneilla vastaanottajilla. Kirjoittajat uskovat, että CD34+c-kit+-fenotyypin omaavat ruskuaispussin solut eivät ainoastaan eroa AGM-alueen soluista kyvyssään uudelleenpopuloida köyhtyneitä hematopoieettisia elimiä, vaan ne myös palauttavat hematopoieesin tehokkaammin, koska ruskuaispussi sisältää niitä lähes 37 kertaa enemmän.

On huomattava, että kokeissa käytettiin ruskuaispussin hematopoieettisia soluja, joissa oli hematopoieettisten kantasolujen markkeriantigeenejä (c-kit+ ja/tai CD34+ ja CD38+). Nämä solut injektoitiin suoraan naarashiirten jälkeläisten maksaan tai vatsaontelon laskimoon, kun naarashiiret saivat busulfaani-injektion tiineyden 18. päivänä. Tällaisilla vastasyntyneillä eläimillä niiden oma myelopoieesi heikkeni jyrkästi busulfaanin aiheuttaman hematopoieettisten kantasolujen eliminaation vuoksi. Ruskuaispussin hematopoieettisten kantasolujen siirron jälkeen vastaanottajien ääreisveressä havaittiin 11 kuukauden ajan muodostuneita elementtejä, jotka sisälsivät luovuttajamarkkerin - glyserofosfaattidehydrogenaasin. Havaittiin, että ruskuaispussin HSC-solut palauttavat lymfoidi-, myeloidi- ja erytroidilinjan solujen sisällön veressä, kateenkorvassa, pernassa ja luuytimessä, ja kimeerismin taso oli korkeampi ruskuaispussisolujen intrahepaattisen kuin laskimonsisäisen annon tapauksessa. Kirjoittajat uskovat, että varhaisvaiheen alkioiden (jopa 10 päivää) ruskuaispussin HSC-solut vaativat alustavaa vuorovaikutusta maksan hematopoieettisen mikroympäristön kanssa voidakseen asuttaa onnistuneesti aikuisten vastaanottajien hematopoieettisia elimiä. On mahdollista, että alkionkehityksessä on ainutlaatuinen kehitysvaihe, jossa ruskuaispussin solut, jotka aluksi siirtyvät maksaan, saavat sitten kyvyn asuttaa kypsien vastaanottajien hematopoieettisten elinten stroomaa.

Tässä suhteessa on huomattava, että immuunijärjestelmän solujen kimeerismiä havaitaan melko usein luuydinsolujen siirron jälkeen säteilytetyille kypsille vastaanottajille - jälkimmäisen veressä luovuttajafenotyypin soluja löytyy melko suurina määrinä vastaanottajan B-, T-lymfosyyteistä ja granulosyyteistä, mikä jatkuu vähintään 6 kuukautta.

Nisäkkäiden hematopoieettiset solut havaitaan morfologisilla menetelmillä ensimmäisen kerran alkionkehityksen seitsemäntenä päivänä, ja niitä edustavat hematopoieettiset saarekkeet ruskuaispussin verisuonten sisällä. Luonnollinen hematopoieettinen erilaistuminen ruskuaispussissa rajoittuu kuitenkin primaarisiin punasoluihin, jotka säilyttävät tumat ja syntetisoivat sikiön hemoglobiinia. Siitä huolimatta perinteisesti uskottiin, että ruskuaispussi toimii ainoana HSC-solujen lähteenä, jotka siirtyvät kehittyvän alkion hematopoieettisiin elimiin ja tarjoavat lopullisen hematopoieesin aikuisilla eläimillä, koska HSC-solujen ilmestyminen alkion kehoon osuu samaan aikaan ruskuaispussin ja alkion verisuoniston sulkeutumisen kanssa. Tätä näkökulmaa tukevat tiedot siitä, että ruskuaispussin solut in vitro -kloonauksessa tuottavat granulosyyttejä ja makrofageja ja in vivo - pernan pesäkkeitä. Sitten elinsiirtokokeiden aikana todettiin, että ruskuaispussin hematopoieettiset solut, jotka itse ruskuaispussissa kykenevät erilaistumaan vain primaariseksi punasoluiksi, vastasyntyneiden ja aikuisten SCID-hiirten maksan mikroympäristössä, köyhdytetyssä kateenkorvassa tai stroomaravintoaineessa, saavat kyvyn asuttaa hematopoieettisia elimiä uudelleen kaikkien hematopoieettisten linjojen palautuessa myös aikuisilla vastaanottajaeläimillä. Periaatteessa tämä antaa meille mahdollisuuden luokitella ne todellisiksi HSC-soluiksi - soluiksi, jotka toimivat postnataalisella ajanjaksolla. Oletetaan, että ruskuaispussi yhdessä AGM-alueen kanssa toimii HSC-solujen lähteenä nisäkkäiden lopulliselle hematopoieesille, mutta niiden vaikutus hematopoieettisen järjestelmän kehitykseen on edelleen epäselvä. Kahden hematopoieettisen elimen olemassaolon biologinen merkitys, joilla on samanlaiset toiminnot varhaisessa nisäkkäiden alkionkehityksessä, on myös epäselvä.

Näiden kysymysten vastausten etsintä jatkuu. In vivo -kokeilla pystyttiin osoittamaan 8–8,5 päivän ikäisten alkioiden ruskuaispussissa lymfopoeesia palauttavia soluja subletaalisesti sädehoitoa saaneilla SCID-hiirillä, joilla oli huomattava T- ja B-lymfosyyttien puutos. Ruskuaispussin hematopoieettisia soluja injektoitiin sekä vatsaontelonsisäisesti että suoraan pernaan ja maksaan. 16 viikon kuluttua vastaanottajilla havaittiin luovuttajan MHC antrxgeeneillä leimattuja TCR/CD34 CD4+ ja CD8+ T-lymfosyyttejä sekä B-220+IgM+ B-lymfosyyttejä. Samaan aikaan kirjoittajat eivät löytäneet 8–8,5 päivän ikäisten alkioiden kehosta kantasoluja, jotka kykenisivät tällaiseen immuunijärjestelmän palauttamiseen.

Ruskuaispussin hematopoieettisilla soluilla on korkea lisääntymispotentiaali ja ne kykenevät pitkäkestoiseen itselisääntymiseen in vitro. Jotkut kirjoittajat tunnistavat nämä solut HSC-soluiksi erytroidisten progenitorisolujen pitkittyneen (lähes 7 kuukautta) muodostumisen perusteella, jotka eroavat erytroidisen linjan luuytimen progenitoreista pidemmän kulkuajan, suurempien pesäkkeiden koon, lisääntyneen herkkyyden kasvutekijöille ja pidemmän lisääntymisen suhteen. Lisäksi sopivissa ruskuaispussisolujen viljelyolosuhteissa in vitro muodostuu myös lymfoidiprogenitorisoluja.

Esitetyt tiedot antavat meille yleisesti ottaen mahdollisuuden pitää ruskuaispussia HSC-solujen lähteenä, jotka ovat vähemmän sitoutuneita ja joilla on siten suurempi proliferatiivisen potentiaalin kuin luuytimen kantasoluilla. Huolimatta siitä, että ruskuaispussi sisältää pluripotentteja hematopoieettisia progenitorisoluja, jotka ylläpitävät erilaisia hematopoieettisia erilaistumislinjoja in vitro pitkään, ainoa kriteeri HSC-solujen täydellisyydelle on niiden kyky pitkällä aikavälillä asuttaa uudelleen vastaanottajan hematopoieettisia elimiä, joiden hematopoieettiset solut ovat tuhoutuneet tai geneettisesti viallisia. Näin ollen keskeinen kysymys on, voivatko ruskuaispussin pluripotentit hematopoieettiset solut siirtyä ja asuttaa hematopoieettisia elimiä, ja onko suositeltavaa tarkistaa tunnettuja tutkimuksia, jotka osoittavat niiden kyvyn asuttaa uudelleen kypsien eläinten hematopoieettisia elimiä muodostaen päähematopoieettisia linjoja. Lopullisten GSC-solujen alkionsisäisiä lähteitä tunnistettiin lintualkioissa jo 1970-luvulla, mikä jo silloin kyseenalaisti vakiintuneet ajatukset GSC-solujen alkion ulkopuolisesta alkuperästä, mukaan lukien muiden selkärankaisluokkien edustajissa. Viime vuosina on julkaistu julkaisuja vastaavanlaisten nisäkkäiden ja ihmisten alkionsisäisten alueiden, jotka sisältävät sikiön kantasoluja, esiintymisestä.

On jälleen kerran huomattava, että perustiedot tällä alalla ovat erittäin tärkeitä käytännön solusiirto-opinnoissa, koska ne auttavat paitsi määrittämään ensisijaisen hematopoieettisten solujen lähteen, myös selvittämään primaaristen hematopoieettisten solujen vuorovaikutuksen piirteet geneettisesti vieraan organismin kanssa. Tiedetään, että ihmisen sikiön maksan hematopoieettisten kantasolujen lisääminen lampaan alkioon organogeneesin vaiheessa johtaa kimeerieläinten syntymiseen, joiden veressä ja luuytimessä on stabiilisti 3–5 % ihmisen hematopoieettisista soluista. Samaan aikaan ihmisen HSC:t eivät muuta karyotyyppiään, säilyttäen korkean lisääntymisnopeuden ja kyvyn erilaistua. Lisäksi siirretyt ksenogeeniset HSC:t eivät ole ristiriidassa isäntäorganismin immuunijärjestelmän ja fagosyyttien kanssa eivätkä muutu kasvainsoluiksi, mikä muodosti perustan perinnöllisen geneettisen patologian kohdunsisäisen korjausmenetelmien intensiiviselle kehittämiselle käyttämällä HSC:itä tai ESC:itä, jotka on transfektoitu puutteellisilla geeneillä.

Mutta missä alkionkehityksen vaiheessa on tarkoituksenmukaisempaa suorittaa tällainen korjaus? Ensimmäistä kertaa hematopoieesiin määritetyt solut ilmestyvät nisäkkäille heti implantaation jälkeen (6. tiineyspäivä), kun hematopoieettisen erilaistumisen ja oletettujen hematopoieettisten elinten morfologiset merkit ovat vielä puuttuneet. Tässä vaiheessa hiiren alkion hajanaiset solut kykenevät asuttamaan uudelleen säteilytettyjen vastaanottajien hematopoieettisia elimiä muodostamalla punasoluja ja lymfosyyttejä, jotka eroavat isäntäsoluista hemoglobiinin tai glyserofosfaatti-isomeraasin tyypin sekä luovuttajasolujen ylimääräisen kromosomimarkkerin (Tb) perusteella. Nisäkkäillä, kuten linnuillakin, samanaikaisesti ruskuaispussin kanssa, ennen yhteisen verisuonistokerroksen sulkeutumista, hematopoieettiset solut ilmestyvät suoraan alkion kehoon paraaorttiseen splanchnopleuraan. AA4.1+-fenotyypin hematopoieettiset solut eristettiin AGM-alueelta ja karakterisoitiin multipotenteiksi hematopoieettisiksi soluiksi, jotka muodostavat T- ja B-lymfosyyttejä, granulosyyttejä, megakaryosyyttejä ja makrofageja. Fenotyypillisesti nämä multipotentit progenitorisolut ovat hyvin lähellä aikuisten eläinten luuytimen HSC-soluja (CD34+c-kit+). Multipotenttien AA4.1+-solujen määrä kaikista AGM-alueen soluista on pieni - ne muodostavat enintään 1/12 sen osasta.

Ihmisalkiossa on myös tunnistettu alkionsisäinen alue, joka sisältää eläinten AGM-alueelle homologisia HSC-soluja. Lisäksi ihmisillä yli 80 % korkean proliferatiivisen potentiaalin omaavista multipotenteista soluista sijaitsee alkion kehossa, vaikka tällaisia soluja on myös ruskuaispussissa. Niiden sijainnin yksityiskohtainen analyysi osoitti, että satoja tällaisia soluja on kerääntynyt tiiviisiin ryhmiin, jotka sijaitsevat lähellä selkäaortan vatsaseinämän endoteeliä. Fenotyypillisesti ne ovat CD34CD45+Lin-soluja. Sitä vastoin ruskuaispussissa, samoin kuin muissa alkion hematopoieettisissa elimissä (maksa, luuydin), tällaiset solut ovat yksittäisiä.

Näin ollen ihmisalkiossa AGM-alue sisältää hematopoieettisten solujen klustereita, jotka ovat läheisesti yhteydessä selkäaortan ventraaliseen endoteeliin. Tämä yhteys jäljitetään myös immunokemiallisella tasolla - sekä hematopoieettisten klustereiden solut että endoteelisolut ilmentävät verisuonten endoteelikasvutekijää, Flt-3-ligandia, niiden reseptoreita FLK-1 ja STK-1 sekä leukemiakantasolujen transkriptiotekijää. AGM-alueella mesenkymaalisia johdannaisia edustaa tiheä pyöreiden solujen juoste, joka sijaitsee koko selkäaortan suuntaisesti ja ilmentää tenaskiini C:tä - perusaineen glykoproteiinia, joka osallistuu aktiivisesti solujen väliseen vuorovaikutukseen ja migraatioon.

AGM-alueen multipotentit kantasolut palauttavat siirron jälkeen nopeasti hematopoieesin kypsillä säteilytetyillä hiirillä ja tarjoavat tehokkaan hematopoieesin pitkäksi aikaa (jopa 8 kuukautta). Kirjoittajat eivät löytäneet tällaisia ominaisuuksia omaavia soluja ruskuaispussista. Tämän tutkimuksen tuloksia vahvistavat toisen tutkimuksen tiedot, jotka osoittivat, että varhaisen kehitysvaiheen alkioissa (10,5 päivää) AGM-alue on ainoa HSC:n määritelmää vastaavien solujen lähde, palauttaen myeloidisen ja lymfaattisen hematopoieesin kypsillä säteilytetyillä vastaanottajilla.

AGM-S3-stroomasolukanta eristettiin AGM-alueelta, jonka solut tukevat sitoutuneiden progenitorisolujen CFU-GM, BFU-E, CFU-E ja sekatyyppisten pesäkettä muodostavien yksiköiden muodostumista viljelmässä. Jälkimmäisten pitoisuus AGM-S3-solulinjan solujen syöttökerroksessa viljelyn aikana kasvaa 10-80-kertaiseksi. Siten AGM-alueen mikroympäristö sisältää strooman perussoluja, jotka tukevat tehokkaasti hematopoieesia, joten AGM-alue itsessään voi hyvinkin toimia alkion hematopoieettisena elimenä - definitiivisten HSC-solujen eli aikuisen eläimen hematopoieettisen kudoksen muodostavien HSC-solujen lähteenä.

AGM-alueen solukoostumuksen laajennettu immunofenotyypitys osoitti, että se sisältää paitsi multipotentteja hematopoieettisia soluja, myös myeloidisten ja lymfoidisolujen (T- ja B-lymfosyytit) erilaistumiseen sitoutuneita soluja. Yksittäisten AGM-alueen CD34+c-kit+ -solujen molekyylianalyysi polymeraasiketjureaktiolla paljasti kuitenkin vain beeta-globiini- ja myeloperoksidaasigeenien aktivoitumisen, mutta ei CD34:n, Thy-1:n ja 15:n synteesiä koodaavien lymfoidigeenien aktivoitumisen. Sukulinjaspesifisten geenien osittainen aktivaatio on ominaista HSC-solujen ja progenitorisolujen muodostumisen varhaisille ontogeneettisille vaiheille. Ottaen huomioon, että sitoutuneiden progenitorisolujen määrä 10-päiväisen alkion AGM-alueella on 2–3 kertaluokkaa pienempi kuin maksassa, voidaan väittää, että alkionkehityksen 10. päivänä hematopoieesi AGM-alueella on vasta alkamassa, kun taas sikiön tärkeimmässä hematopoieettisessa elimessä hematopoieettiset solut ovat jo kehittyneet tänä aikana.

Toisin kuin aikaisemmat (9–11 päivää vanhat) ruskuaispussin ja AGM-alueen hematopoieettiset kantasolut, jotka täyttävät vastasyntyneen, mutta eivät aikuisen organismin hematopoieettisen mikroympäristön, 12–17 päivää vanhan alkion maksan hematopoieettiset progenitorisolut eivät enää vaadi varhaista postnataalista mikroympäristöä ja täyttävät aikuisen eläimen hematopoieettiset elimet yhtä hyvin kuin vastasyntyneen. Alkion maksan HSC-solujen siirron jälkeen säteilytettyjen aikuisten vastaanottajahiirten hematopoieesi oli luonteeltaan polyklonaalista. Lisäksi merkittyjen pesäkkeiden avulla osoitettiin, että siirrettyjen kloonien toiminta on täysin aikuisen luuytimessä havaittavan klonaalisen peräkkäisjärjestyksen alainen. Näin ollen alkion maksan HSC-solut, jotka on merkitty mahdollisimman lempeissä olosuhteissa ilman eksogeenisten sytokiinien esistimulaatiota, omaavat jo aikuisten HSC-solujen tärkeimmät ominaisuudet: ne eivät vaadi varhaista postembryonista mikroympäristöä, siirtyvät syvään lepotilaan siirron jälkeen ja mobilisoituvat klonaaliseen muodostumiseen peräkkäin klonaalisen peräkkäismallin mukaisesti.

On selvää, että klonaalisten periksiantojen ilmiötä on tarkasteltava tarkemmin. Erytropoieesia suorittavat hematopoieettiset kantasolut, joilla on korkea lisääntymispotentiaali ja kyky erilaistua kaikiksi verisolujen kantasoluiksi. Normaalissa hematopoieesin intensiteetissä useimmat hematopoieettiset kantasolut ovat lepotilassa ja mobilisoituvat lisääntymiseen ja erilaistumiseen muodostaen peräkkäin klooneja, jotka korvaavat toisensa. Tätä prosessia kutsutaan klonaalisten periksiantojen ilmiöksi. Kokeellista näyttöä klonaalisten periksiantojen esiintymisestä hematopoieettisessa järjestelmässä saatiin tutkimuksissa, joissa käytettiin retroviruksen geeninsiirrolla merkittyjä HSC-soluja. Aikuisilla eläimillä hematopoieesia ylläpitävät monet samanaikaisesti toimivat hematopoieettiset kloonit, HSC-solujen johdannaiset. Klonaalisten periksiantojen ilmiön perusteella on kehitetty HSC-solujen tunnistamiseen tarkoitettu uudelleenpopulaatiomenetelmä. Tämän periaatteen mukaisesti erotetaan toisistaan pitkäaikainen hematopoieettisten kantasolujen (LT-HSC), jotka kykenevät palauttamaan hematopoieettisen järjestelmän koko elämän ajan, ja lyhytaikainen HSC, joka suorittaa tätä tehtävää rajoitetun ajan.

Jos hematopoieettisia kantasoluja tarkastellaan uudelleenpopulaatiolähestymistavan näkökulmasta, alkion maksan hematopoieettisten solujen erityispiirre on niiden kyky luoda pesäkkeitä, jotka ovat kooltaan huomattavasti suurempia kuin napanuoraveren tai luuytimen HSC-solujen kasvussa olevat pesäkkeet, ja tämä pätee kaikentyyppisiin pesäkkeisiin. Pelkästään tämä seikka osoittaa alkion maksan hematopoieettisten solujen korkeamman proliferatiivisen potentiaalin. Alkion maksan hematopoieettisten progenitorisolujen ainutlaatuinen ominaisuus on lyhyempi solusykli verrattuna muihin lähteisiin, mikä on erittäin tärkeää hematopoieettisten elinten uudelleenpopulaation tehokkuuden kannalta elinsiirron aikana. Kypsän organismin lähteistä saadun hematopoieettisen suspension solukoostumuksen analyysi osoittaa, että ontogeneesin kaikissa vaiheissa ydinsoluja edustavat pääasiassa lopullisesti erilaistuneet solut, joiden lukumäärä ja fenotyyppi riippuvat hematopoieettisen kudoksen luovuttajan ontogeneettisestä iästä. Erityisesti luuytimen ja napanuoraveren mononukleaaristen solujen suspensiot koostuvat yli 50 %:sta lymfoidisarjan kypsistä soluista, kun taas alkion maksan hematopoieettisessa kudoksessa on alle 10 % lymfosyyttejä. Lisäksi alkion ja sikiön maksassa myeloidisen linjan soluja edustaa pääasiassa erytroidisarja, kun taas napanuoraveressä ja luuytimessä granulosyytti-makrofagielementit ovat vallitsevia.

On myös tärkeää, että alkion maksa sisältää täydellisen sarjan varhaisimpia hematopoieettisia esiasteita. Jälkimmäisistä on huomattava erytroidiset, granulopoieettiset, megakaryopoieettiset ja monilinjaiset pesäkkeitä muodostavat solut. Niiden primitiivisemmät esiasteet - LTC-IC - kykenevät lisääntymään ja erilaistumaan in vitro 5 viikon ajan tai kauemmin, ja ne säilyttävät myös toiminnallisen aktiivisuutensa kiinnittymisen jälkeen vastaanottajan elimistöön allogeenisen ja jopa ksenogeenisen siirron aikana immuunipuutteisille eläimille.

Alkion maksassa olevien erytroidisolujen vallitsevan määrän biologinen tarkoituksenmukaisuus (jopa 90 % hematopoieettisten elementtien kokonaismäärästä) johtuu tarpeesta tarjota kehittyvän sikiön nopeasti kasvavalle veritilavuudelle punasolumassaa. Alkion maksassa erytropoieesia edustavat eri kypsyysasteiset ydinerytroidin esiasteet, jotka sisältävät sikiön hemoglobiinia (a2u7), joka korkeamman happiaffiniteettinsa ansiosta varmistaa jälkimmäisen tehokkaan imeytymisen äidin verestä. Erytropoieesin tehostuminen alkion maksassa liittyy paikalliseen erytropoietiinin (EPO) synteesin lisääntymiseen. On huomionarvoista, että pelkkä erytropoietiinin läsnäolo riittää hematopoieettisten solujen hematopoieettisen potentiaalin toteutumiseen alkion maksassa, kun taas luuytimen ja napanuoraveren HSC-solujen sitoutumiseen erytropoieesiin tarvitaan sytokiinien ja kasvutekijöiden yhdistelmä, joka koostuu EPO:sta, SCF:stä, GM-CSF:stä ja IL-3:sta. Samaan aikaan alkion maksasta eristetyt varhaiset hematopoieettiset progenitorisolut, joilla ei ole EPO-reseptoreita, eivät reagoi eksogeeniseen erytropoietiiniin. Erytropoieesin indusoimiseksi alkion maksan mononukleaaristen solujen suspensiossa tarvitaan kehittyneempiä erytropoietiinille herkkiä soluja, joilla on CD34+CD38+-fenotyyppi ja jotka ilmentävät EPO-reseptoria.

Kirjallisuudessa ei vieläkään ole yksimielisyyttä hematopoieesin kehityksestä alkionkaudella. Hematopoieettisten kantasolujen ekstra- ja intraembryonisten lähteiden olemassaolon toiminnallista merkitystä ei ole vahvistettu. Ei kuitenkaan ole epäilystäkään siitä, että ihmisen alkionkehityksessä maksa on hematopoieesin keskeinen elin ja toimii 6.–12. raskausviikolla pernassa, kateenkorvassa ja luuytimessä asuttavien hematopoieettisten kantasolujen pääasiallisena lähteenä. GDR:t varmistavat vastaavien toimintojen suorittamisen kehityksen pre- ja postnataalisella kaudella.

On jälleen kerran huomattava, että alkion maksalle on muihin lähteisiin verrattuna ominaista korkein HSC-pitoisuus. Noin 30 %:lla alkion maksan CD344-soluista on CD38-fenotyyppi. Samaan aikaan lymfoidiprogenitorisolujen (CD45+) määrä maksassa hematopoieesin alkuvaiheessa on enintään 4 %. On todettu, että sikiön kehittyessä 7.–17. raskausviikolla B-lymfosyyttien määrä kasvaa asteittain 1,1 %:n kuukausittaisella ”askelella”, kun taas HSC-solujen taso laskee pysyvästi.

Hematopoieettisten kantasolujen toiminnallinen aktiivisuus riippuu myös niiden lähteen alkionkehitysajasta. Ihmisalkioiden maksasolujen pesäkkeidenmuodostusaktiivisuuden tutkimus 6-8 ja 9-12 raskausviikolla puolinestemäisessä väliaineessa SCF:n, GM-CSF:n, IL-3:n, IL-6:n ja EPOn läsnä ollessa osoitti, että pesäkkeiden kokonaismäärä on 1,5 kertaa suurempi, kun alkion maksan HSC-soluja kylvetään kehityksen alkuvaiheessa. Samaan aikaan myelopoieesin kantasolujen, kuten CFU-GEMM:n, määrä maksassa 6-8 raskausviikolla on yli kolme kertaa suurempi kuin niiden määrä 9-12 raskausviikolla. Yleisesti ottaen alkioiden hematopoieettisten maksasolujen pesäkkeidenmuodostusaktiivisuus raskauden ensimmäisen kolmanneksen aikana oli merkittävästi korkeampi kuin sikiön maksasolujen raskauden toisen kolmanneksen aikana.

Yllä olevat tiedot osoittavat, että alkion maksalle alkionkehityksen alussa on ominaista paitsi lisääntynyt varhaisten hematopoieettisten kantasolujen pitoisuus, myös sen hematopoieettisille soluille on ominaista laajempi erilaistumisen kirjo erilaisiksi solulinjoiksi. Näillä alkion maksan hematopoieettisten kantasolujen toiminnallisen aktiivisuuden piirteillä voi olla tietty kliininen merkitys, koska niiden laadulliset ominaisuudet mahdollistavat voimakkaan terapeuttisen vaikutuksen odottamisen siirrettäessä jopa pieni määrä soluja, jotka on saatu raskauden alkuvaiheessa.

Tehokkaan siirron edellyttämien hematopoieettisten kantasolujen määrän ongelma on kuitenkin edelleen avoin ja ajankohtainen. Sitä yritetään ratkaista hyödyntämällä alkion maksan hematopoieettisten solujen suurta potentiaalia itselisääntymiseen in vitro, kun niitä stimuloidaan sytokiinien ja kasvutekijöiden avulla. Varhaisen alkion maksan HSC-solujen jatkuvalla perfuusiolla bioreaktorissa on 2-3 päivän kuluttua mahdollista saada hematopoieettisten kantasolujen määrä, joka on 15 kertaa suurempi kuin niiden alkuperäinen taso. Vertailun vuoksi on huomattava, että ihmisen napanuoraverestä peräisin olevien HSC-solujen tuotannon 20-kertaiseen kasvuun samoissa olosuhteissa tarvitaan vähintään kaksi viikkoa.

Siten alkion maksa eroaa muista hematopoieettisten kantasolujen lähteistä sekä sitoutuneiden että varhaisten hematopoieettisten progenitorisolujen suuremman pitoisuuden ansiosta. Kasvutekijöiden kanssa viljeltynä CD34+CD45Ra1CD71l0W-fenotyyppiset alkion maksasolut muodostavat 30 kertaa enemmän pesäkkeitä kuin vastaavat napanuoraveren solut ja 90 kertaa enemmän kuin luuytimen HSC:t. Selkeimmät erot määritellyissä lähteissä ovat sekapesäkkeitä muodostavien varhaisten hematopoieettisten progenitorisolujen pitoisuudessa - CFU-GEMM:n määrä alkion maksassa ylittää napanuoraveren ja luuytimen määrät 60 ja 250 kertaa.

On myös tärkeää, että alkionkehityksen 18. viikkoon asti (hematopoieesin alkamisaika luuytimessä) yli 60 % maksasoluista osallistuu hematopoieettisen toiminnan toteuttamiseen. Koska ihmisen sikiöllä ei ole kateenkorvaa ja vastaavasti tymosyyttejä ennen 13. kehitysviikkoa, hematopoieettisten solujen siirto 6–12 raskausviikon alkion maksasta vähentää merkittävästi siirteen ja isännän välisen reaktion riskiä eikä vaadi histoyhteensopivan luovuttajan valintaa, koska se tekee hematopoieettisen kimeerismin saavuttamisen suhteellisen helpoksi.