Napanuoraverestä peräisin olevat hematopoieettiset kantasolut

Napanuoraveri on hyvä hematopoieettisten kantasolujen lähde hematopoieettisten solujen lisääntymispotentiaalin ja uudelleenpopulaatiokyvyn kannalta. On toistuvasti osoitettu, että syntymään mennessä napanuoraveressä on riittävän suuri määrä heikosti sitoutuneita hematopoieettisia kantasoluja. Jotkut kirjoittajat uskovat, että napanuoraverestä tehtävän hematopoieettisten kantasolujen siirron etuna on se, ettei HLA-antigeenien kanssa yhteensopivaa luovuttajaa tarvitse etsiä. Heidän mielestään vastasyntyneen immuunijärjestelmän kypsymättömyys aiheuttaa immunokompetenttien solujen toiminnallisen aktiivisuuden heikkenemistä ja siten vakavan käänteishyljintäreaktion pienempää esiintyvyyttä kuin luuydinsiirrossa. Samaan aikaan napanuoraverestä tehtävän solusiirron eloonjäämisaste ei ole alhaisempi kuin luuydinsolujen, edes silloin, kun käytetään pienempää määrää kantasoluja potilaan painokiloa kohden. Mielestämme kuitenkin kysymykset siirrettyjen napanuoraveren solujen optimaalisesta määrästä, jotka ovat välttämättömiä tehokkaalle kiinnittymiselle vastaanottajan kehoon, niiden immunologisesta yhteensopivuudesta ja useista muista napanuoraverestä tehtävän hematopoieettisten kantasolujen siirron ongelman näkökohdista vaativat vakavampaa analyysia.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Hematopoieettisten kantasolujen ottaminen napanuoraverestä

Napanuoraverestä hematopoieettisten kantasolujen saamiseksi menetelmä edellyttää niiden keräämistä välittömästi lapsen syntymän jälkeen ja niiden erottamista istukasta, kun istukka on kohdussa tai kohdussa, sekä keisarileikkauksen aikana, mutta myös kohdussa. On osoitettu, että jos aika syntymästä vastasyntyneen irtoamiseen istukasta lyhennetään 30 sekuntiin, saadun napanuoraveren määrä kasvaa keskimäärin 25–40 ml. Jos tämä toimenpide suoritetaan myöhemmin, sama määrä verta menetetään. On todettu, että lapsen varhainen irtoaminen istukasta ei aiheuta mitään negatiivisia seurauksia vastasyntyneelle.

Venäjän hematologian ja verensiirtojen tutkimuslaitos on kehittänyt tehokkaita ja edullisia tekniikoita napanuoraveren keräämiseksi sekä normaalin synnytyksen ((70,2+25,8) ml) että keisarileikkauksen ((73,4+25,1) ml) aikana. On ehdotettu menetelmä napanuoraveren erottamiseksi, jossa saadaan riittävän paljon tuma- ja mononukleaarisia soluja - (83,1+9,6) ja (83,4+14,1) %. Napanuoraveren kryosäilytysmenetelmää on parannettu, mikä varmistaa mononukleaaristen solujen ja CFU-GM:n korkean säilyvyyden - (96,8+5,7) ja (89,6+22,6) %. Napanuoraveren keräämiseen tarkoitetun Kompoplast-300-säiliön (Venäjä) avulla käytetyn drenaaatiomenetelmän tehokkuus on määritetty. Kirjoittajat keräsivät napanuoraverta heti lapsen syntymän ja istukasta irtoamisen jälkeen, istukan ollessa kohdussa tai ex utero. Ennen napanuoralaskimon punktiota napanuoraa käsiteltiin kerran 5-prosenttisella joditinktuuralla ja sitten kahdesti 70-prosenttisella etyylialkoholilla. Veri virtasi spontaanisti yhdysputkien kautta säiliöön. Keräystoimenpide kesti enintään 10 minuuttia. Dreenauksella kerättyjen 66 napanuoraverinäytteen keskimääräinen tilavuus oli (72+28) ml, ja leukosyyttien määrä keskimääräisessä kokonaisnäytteen tilavuudessa oli (1,1+0,6) x 107. Napanuoraverta analysoitaessa steriiliyden suhteen (bakteerikontaminaatio, HIV-1, hepatiitti B- ja C-virukset, kuppa ja sytomegalovirusinfektio) hepatiitti C -viruksen IgG-vasta-aineita havaittiin vain yhdessä näytteessä. Toisessa tutkimuksessa istukka asetettiin sikiöpinta alaspäin erityiselle kehykselle heti syntymän jälkeen, ja napanuoraa käsiteltiin 5-prosenttisella jodiliuoksella ja 75-prosenttisella etyylialkoholilla. Napanuora tyhjennettiin verensiirtojärjestelmän (G16) neulalla. Veri virtasi säiliöön spontaanisti. Tällä tavoin kerätyn veren keskimääräinen tilavuus oli (55+25) ml. G. Koglerin ym. työssä... (1996) mukaan napanuoraveri kerättiin suljetulla menetelmällä, ja saatiin suuria määriä verta – keskimäärin (79+26) ml. Kirjoittajat huomauttavat, että 574 napanuoraverinäytteestä noin 7 % sisälsi alle 40 ml verta, mikä ei salli niiden käyttöä elinsiirtoon. K. Isoyama ym. (1996) keräsivät napanuoraverta aktiivisella eksfuusiolla ruiskujen avulla ja saivat keskimäärin 69,1 ml verta (napanuoraveren tilavuus vaihteli 15:stä 135 ml:aan). Lopuksi A. Abdel-Mageed PI ym. (1997) onnistuivat saamaan keskimäärin 94 ml napanuoraverta (56:sta 143 ml:aan) napanuoralaskimon katetroinnin kautta.

Iatrogeenisen infektion ja äidin eritteiden kontaminaation riskin vähentämiseksi on kehitetty suljettu verenkeräysjärjestelmä, joka perustuu Baxter Healthcare Corp.:n, Deerfield, IL (USA), laajalti käytettyyn verensiirtojärjestelmään. Järjestelmä sisältää 62,5 ml CPDA:ta (sitraatti-fosfaatti-dekstroosi adeniinin kanssa) antikoagulanttina. Materiaalin hankintatekniikka on ensiarvoisen tärkeää korkealaatuisen näytteen valmistamiseksi solususpension tilavuuden, sisällön ja puhtauden suhteen. Olemassa olevista napanuoraveren keräysmenetelmistä, jotka luokitellaan perinteisesti suljettuihin, puoliavoimiin ja avoimiin järjestelmiin, etusija tulisi antaa ensimmäiselle, koska suljettu järjestelmä vähentää merkittävästi materiaalin mikrobikontaminaation riskiä sekä solususpension kontaminaatiota äidin soluilla.

A. Nagler ym. (1998) suorittivat vertailevan analyysin kaikkien kolmen napanuoraveren keräysjärjestelmän tehokkuudesta. Ensimmäisessä variantissa toimenpide suoritettiin suljetussa järjestelmässä kuorimalla verta suoraan astiaan. Toisessa variantissa napanuoraveri saatiin tyhjentämällä verta aktiivisesti MP1-ruiskulla, minkä jälkeen istukan laskimot huuhdeltiin ja veri valutettiin samanaikaisesti astiaan (avoin menetelmä). Kolmannessa variantissa veri kerättiin puoliavoimessa järjestelmässä tyhjentämällä sitä aktiivisesti ruiskuilla ja huuhtelemalla se napanuoravaltimon läpi samanaikaisesti tyhjentämällä se astiaan. Ensimmäisessä variantissa kirjoittajat saivat napanuoraverta tilavuudessa (76,4 + 32,1) ml, jonka leukosyyttipitoisuus oli (10,5 + 3,6) x 106 ¹ ml:ssa verta. Toisessa variantissa vastaavat indikaattorit olivat (174,4 + 42,8) ml ja (8,8 + 3,4) x 106 ^/ ml; kolmannessa - (173,7 + 41,3) ml ja (9,3 + 3,8) x 106 ^/ ml. Napanuoraverinäytteiden yleisin infektio havaittiin avointa järjestelmää käytettäessä. Istukan massan ja uutetun veren tilavuuden välillä havaittiin suora korrelaatio - istukan massan kasvaessa kerätyn veren määrä kasvaa.

Napanuoraveren keräämisen jälkeen seuraa erotusvaihe - mononukleaaristen solujen eristäminen ja solususpension puhdistaminen punasoluista. Kokeellisissa olosuhteissa tumalliset solut eristetään sedimentaatiolla metyyliselluloosalla punasolujen ammoniumkloridilla tapahtuvan lysoinnin aikana. Metyyliselluloosaa ei kuitenkaan tule käyttää kliinisiin tarkoituksiin, koska hematopoieettisten kantasolujen hävikki siinä on 50–90 %. Punasolujen lysointia ei myöskään juuri koskaan suoriteta kliinisessä käytössä työliuoksen suurten tilavuuksien vuoksi, vaikka CD34+-fenotyypin omaavien tumallisten solujen sekä CFU-GM- ja CFU-GEMM-toimintoja omaavien progenitorisolujen eristysprosentti tällä tavalla on huomattavasti suurempi. On raportoitu uuden menetelmän, kuten buyant-tiheysliuoksen (BDS72), ilmestymistä mononukleaaristen solujen eristämiseksi tiheysgradientissa. Tällä aineella on seuraavat fysiologiset parametrit: pH - 7,4, osmolaliteetti - 280 mOsm/kg, tiheys - 1,0720 g/ml. Kirjoittajien mukaan sillä voidaan eristää jopa 100 % CD34-positiivisista soluista ja poistaa 98 % punasoluista. BDS72:ta ei kuitenkaan vielä käytetä kliinisesti.

Hyväksytyissä menetelmissä tumallisten solujen eristämiseksi napanuoraverestä käytetään yleensä 10 % hydroksietyylitärkkelysliuosta tai 3 % gelatiiniliuosta. Erytrosyyttien sedimentaation ja tumallisten solujen eristämisen tehokkuus on molemmissa tapauksissa suunnilleen sama. Kun gelatiinia käytetään sedimentaatioaineena, on kuitenkin mahdollista saada hieman suurempi määrä CFU-GM:ää kuin hydroksietyylitärkkelystä käytettäessä. Oletetaan, että CFU-GM:n eristämisen tehokkuuserot johtuvat tumallisten solujen yksittäisten fraktioiden erilaisista sedimentaationopeuksista tai hydroksietyylitärkkelysmolekyylien kyvystä imeytyä hematopoieettisten solujen reseptorien pinnalle ja siten estää niiden herkkyyden CFU-GM:n viljelyssä in vitro käytettäville pesäkkeitä stimuloiville tekijöille. Molemmat sedimentaattorit voivat kuitenkin hyvinkin soveltua tumallisten solujen eristämiseen luotaessa suuria napanuoraveripankkeja.

Napanuoraveren erotus- ja kryosäilytysmenetelmät eivät pohjimmiltaan eroa niistä, joita käytetään aikuisten luovuttajien perifeerisen veren ja luuytimen hematopoieettisten kantasolujen kanssa työskenneltäessä. Mutta valmisteltaessa suurta määrää napanuoraverinäytteitä pankkeihin, erotusmenetelmien on ennen kaikkea oltava edullisia. Siksi valitettavasti tällä hetkellä kliinisiin tarpeisiin käytetään jo testattuja rutiinimenetelmiä napanuoraveren eristämiseksi ja kryosäilyttämiseksi, ja tehokkaammat, mutta kalliit menetelmät ovat edelleen kokeilijoiden käytössä.

Yleisesti ottaen hematopoieettisten solujen lukumäärän arviointikriteerit ja tartuntatautien tunnistamiseksi tehtävien napanuoraveren näytteiden tutkimisvaatimukset on hyväksytty. Napanuoraverestä peräisin olevien hematopoieettisten solujen siirron turvallisuuden varmistamiseksi kaikki verinäytteet on tutkittava ensisijaisesti hematogeenisesti tarttuvien infektioiden ja geneettisten sairauksien varalta. Useat kirjoittajat suosittelevat lisäksi erityismenetelmiä napanuoraveren tutkimiseksi geneettisten sairauksien, kuten a-talassemian, sirppisoluanemian, adenosiinideaminaasin puutoksen, Brutonin agammaglobulinemian, Hurlerin ja Ponterin tautien, diagnosoimiseksi.

L. Tichelin ja yhteistyökumppaneiden (1998) suositusten mukaan jokainen napanuoraverinäyte on testattava tumallisten solujen, CD34-positiivisten solujen ja CFU-GM:n varalta, HLA-tyypitys on suoritettava ja veriryhmä on määritettävä ABO:n ja sen Rh-tekijän mukaan. Lisäksi on tehtävä bakteriologinen viljely sekä serologiset testit HIV- ja sytomegalovirusinfektion, HBsAg:n, virushepatiitti C:n, HTLY-I:n ja HTLV-II:n (ihmisen T-soluleukemia), kupan ja toksoplasmoosin varalta. Polymeraasiketjureaktio sytomegaloviruksen ja HIV-infektion varalta on pakollinen.

Napanuoraveren keräämismenettely on suoritettava tiukasti lääketieteellisen bioetiikan periaatteiden mukaisesti. Ennen veren keräämistä on saatava raskaana olevan naisen suostumus sen suorittamiseen. Alustavan keskustelun raskaana olevan naisen kanssa tietoisen suostumuksen saamiseksi kaikkiin toimenpiteisiin, veren ottamisesta dokumentaation täyttämiseen, suorittavat vain lääketieteen työntekijät. Missään tapauksessa näitä toimenpiteitä ei saa suorittaa henkilöstö, jolla on biologista, kemiallista, farmaseuttista tai muuta ei-lääketieteellistä koulutusta, koska se rikkoo vakiintuneita bioetiikan ja ihmisoikeuksien normeja. Jos HBsAg-kantajuuden, hepatiitti C:n, HIV-infektion ja kupan vasta-aineiden esiintymisen testitulos on positiivinen, napanuoraverta ei kerätä, ja jo kerätyn verinäytteen hylkääminen ja tuhoaminen on tarpeen. On huomattava, että piilevien infektioiden kantajuus vastasyntyneillä on paljon harvinaisempaa kuin aikuisilla, joten hematogeenisen siirtymisen ja infektiokomplikaatioiden kehittymisen todennäköisyys napanuoraveren hematopoieettisten solujen infuusioiden aikana on huomattavasti pienempi kuin aikuisen luovuttajan luuytimen käytön tapauksessa elinsiirtoon.

Napanuoraveren kliinisen käytön tärkeä osa on elinsiirtojen arviointi, joka perustuu hematopoieettisten kantasolujen määrän määrittämiseen napanuoraverinäytteessä ja elinsiirtoon tarvittavien soluannosten määrään. Tällä hetkellä ei ole vielä kehitetty standardeja elinsiirtoon tarvittavien napanuoraveren solujen optimaaliselle määrälle. Yleisesti hyväksyttyä näkökulmaa ei ole edes sellaisiin rutiiniparametreihin kuin CD34-positiivisten solujen lukumäärä ja CFU-GM. Jotkut kirjoittajat arvioivat hematopoieettisten solujen potentiaalia analysoimalla pitkäaikaisia viljelmiä ja määrittämällä granulosyyteille, punasoluille, monosyyteille ja megakaryosyyteille yhteisten pesäkettä muodostavien yksiköiden - CFU-GEMM - pitoisuuden.

Kliinisessä ympäristössä napanuoraverensiirron tavanomainen arviointi sisältää kuitenkin tyypillisesti vain tumallisten tai mononukleaaristen solujen lukumäärän määrittämisen.

Napanuoraveren hematopoieettisten kantasolujen säilytys

Napanuoraveren hematopoieettisten solujen säilytystekniikassa on myös joitakin ongelmia. Hematopoieettisten kantasolujen kryosäilytyksessä optimaalisen pakastusmenetelmän saavuttamiseksi on tarpeen vähentää napanuoraveren määrää mahdollisimman paljon ja poistaa punasolut etukäteen hemolyysin ja yhteensopimattomuusreaktion kehittymisen riskin välttämiseksi punasoluantigeeneille (ABO, Rh). Näihin tarkoituksiin soveltuvat erilaiset menetelmät tumallisten solujen eristämiseksi. Viime vuosisadan alussa yleisimmin käytetty menetelmä oli tumallisten solujen eristäminen tiheysgradientissa, joka perustui Ficolliin, jonka tiheys oli 1,077 g/ml, tai Percolliin, jonka tiheys oli 1,080 g/ml. Napanuoraveren erottaminen tiheysgradientissa mahdollistaa pääasiassa mononukleaaristen solujen eristämisen, mutta johtaa hematopoieettisten kantasolujen merkittäviin häviöihin - jopa 30-50%.

Hydroksietyylitärkkelyksen sedimentaatiotehokkuutta napanuoraveren hematopoieettisten solujen eristämisessä arvioidaan eri tavoin. Jotkut kirjoittajat viittaavat menetelmän heikompaan erottelun laatuun, kun taas toiset tutkijat päinvastoin suosivat kaikkien mahdollisten menetelmien joukossa napanuoraveren HSC-solujen eristämistä 6-prosenttisella hydroksietyylitärkkelysliuoksella. Samalla korostetaan hematopoieettisten solujen sedimentaation korkeaa tehokkuutta, joka joidenkin tietojen mukaan nousee 84 prosentista 90 prosenttiin.

Eri näkökulman kannattajat uskovat, että käytännössä kaikkiin fraktiointimenetelmiin liittyy suuria tumallisten solujen häviöitä, ja ehdottavat erottelua sentrifugoimalla, jossa napanuoraveri jaetaan kolmeen fraktioon: punasoluihin, leukosyyttirenkaaseen ja plasmaan. Eristämällä solut tällä tavalla kirjoittajat havaitsivat, että mononukleaaristen solujen, varhaisten hematopoieettisten progenitorisolujen ja CD34+-immunofenotyypin omaavien solujen pitoisuus oli lopulta 90, 88 ja 100 % alkuperäisestä tasosta. Myös muut tutkijat saivat samankaltaisia arvoja tällä menetelmällä puhdistettujen napanuoraveren solujen lisääntymiselle: sedimentaation jälkeen eristettiin 92 % tumallisista soluista, 98 % mononukleaarisista soluista, 96 % CD34-positiivisista soluista ja 106 % pesäkettä muodostavista yksiköistä.

1990-luvun lopulla gelatiinia käytettiin laajalti sedimentaatioaineena. Kliinisessä käytännössä gelatiinia on käytetty hematopoieettisten kantasolujen eristämiseen napanuoraverestä vuodesta 1994 lähtien. Käytettäessä 3-prosenttista gelatiiniliuosta tumallisten solujen eristämisen tehokkuus on 88–94 %. Gelatiinin laajamittainen käyttö napanuoraveripankin luomisessa on vahvistanut sen edut muihin sedimentaatioaineisiin verrattuna. Kaikkien edellä mainittujen tumallisten solujen eristämismenetelmien tehokkuuden vertaileva analyysi niiden peräkkäisen käytön olosuhteissa kullakin testatulla napanuoraverinäytteellä on osoittanut, että 3-prosenttinen gelatiiniliuos on optimaalinen sedimentaatioaine sekä CD34+/CD45+-fenotyypin omaavien mononukleaaristen solujen saannon että CFU-GM- ja CFU-GEMM-solujen lukumäärän suhteen. Ficoll-tiheysgradienttia käyttävät menetelmät sekä hydroksietyylitärkkelyksen ja metyyliselluloosan käyttö olivat merkittävästi vähemmän tehokkaita, ja hematopoieettisten solujen hävikki oli 60 %.

Napanuoraveren kantasolujen siirtomäärien kasvu liittyy paitsi niiden hankintamenetelmien kehittämiseen myös niiden varastointiin. Napanuoraveren pitkäaikaiseen säilytykseen valmisteluun ja näytteiden optimaalisen kryosäilytystekniikan valintaan liittyy monia ongelmia. Näitä ovat muun muassa erotusmenetelmien toteutettavuus, erilaisten kryosäilytysalustojen käyttö ja sulatettujen solujen siirtoa varten valmistelumenetelmien soveltaminen. Alkuperäisten napanuoraverinäytteiden kuljetus tapahtuu usein hematologisista keskuksista kaukana olevilta alueilta. Tässä yhteydessä herää napanuoraveren hyväksyttävien säilytysaikojen ongelma sen hankintahetkestä kryosäilytyksen alkuun, mikä on erityisen tärkeää napanuoraveripankkeja perustettaessa.

Napanuoraveren hematopoieettisten solujen toiminnallista aktiivisuutta pitkäaikaisen (jopa 12 vuotta) nestemäisessä typessä säilytyksen jälkeen selvittäneessä tutkimuksessa on osoitettu, että noin 95 % hematopoieettisista soluista ei menetä korkeaa lisääntymiskykyään tänä aikana. S. Yurasovin ja yhteistyökumppaneiden (1997) työssä osoitettiin, että napanuoraveren säilyttäminen huoneenlämmössä (22 °C) tai 4 °C:ssa 24 ja 48 tunnin ajan ei vähennä merkittävästi hematopoieettisten solujen elinkykyä, joka on vastaavasti 92 ja 88 % alkuperäisestä tasosta. Jos säilytysaikaa kuitenkin pidennetään kolmeen päivään, elinkelpoisten tumallisten solujen määrä napanuoraveressä vähenee merkittävästi. Samaan aikaan muut tutkimukset ovat osoittaneet, että 2–3 päivän säilytyksessä 22 tai 4 °C:ssa kypsien granulosyyttien, eikä hematopoieettisten solujen, elinkyky kärsii ennen kaikkea.

Napanuoraveren hematopoieettisten kantasolujen elinkelpoisuuteen voivat vaikuttaa negatiivisesti napanuoraveren keräysjärjestelmien komponentit. Analyysi erilaisten kalsiumionien sitoutumiseen perustuvan antikoagulanttien (ACD, EDTA, XAPD-1) vaikutuksesta hematopoieettisiin kantasoluihin napanuoraveren säilytysolosuhteissa 24–72 tunnin ajan paljasti niiden negatiivisen vaikutuksen tumallisten solujen elinkelpoisuuteen. Tässä suhteessa kirjoittajat suosittelevat PBS:n (fosfaattipuskuriliuoksen) käyttöä, johon on lisätty natiivia hepariinia ilman säilöntäainetta pitoisuudella 20 U/ml, mikä heidän mielestään mahdollistaa fraktioimattoman napanuoraveren säilytysajan pidentämisen 72 tuntiin ja säilyttää pesäkettä muodostavien yksiköiden toiminnallisen aktiivisuuden. CFU-GM:n ja CFU-G:n turvallisuutta koskeva tutkimus osoitti kuitenkin, että napanuoraveren säilytysaika ennen kryosäilytystä ei saisi ylittää yhdeksää tuntia. Tässä tapauksessa on luonnollisesti noudatettava periaatetta, että ristiriitaisten tietojen tapauksessa tulisi käyttää napanuoraverelle suositeltua vähimmäissäilytysaikaa ja aloittaa eristettyjen solujen ohjelmoitu pakastaminen mahdollisimman pian.

Napanuoraverestä peräisin olevien hematopoieettisten kantasolujen pakastamisessa käytetään yleensä 10-prosenttista DMSO-liuosta kryosuoja-aineena. Tämän pitoisuuden dimetyylisulfoksidilla on kuitenkin voimakkaan kryosuojaavan vaikutuksen lisäksi myös suora sytotoksinen vaikutus, jopa minimaalisella altistuksella napanuoraverestä peräisin oleville hematopoieettisille soluille. DMSO:n sytotoksisen vaikutuksen vähentämiseksi käytetään nolla-altistuslämpötilaa, kaikkien käsittelyjen nopeutta lisätään ja napanuoraverinäytteiden sulatuksen jälkeen suoritetaan useita pesuja.

Ukrainan lääketieteellisen akatemian hematologian ja verensiirtojen instituutti on vuodesta 1995 lähtien kehittänyt tieteellistä suuntausta, jonka tavoitteena on napanuoraveren kattava tutkimus vaihtoehtoisena hematopoieettisten kantasolujen lähteenä. Erityisesti on kehitetty uusia teknologioita fraktioimattoman ja fraktioidun napanuoraveren hematopoieettisten solujen matalan lämpötilan kryosäilytykseen. Kryosuoja-aineena käytetään pienimolekyylistä lääketieteellistä polyvinyylipyrrolidonia. Fraktioimattoman napanuoraveren kryosäilytysmenetelmä perustuu alkuperäiseen teknologiaan solujen esivalmistelussa pakastusta varten ja menetelmään solususpension erityiskäsittelyyn välittömästi ennen elinsiirtoa.

Yksi tärkeimmistä kryosäilytettyjen hematopoieettisten kantasolujen toiminnallisen aktiivisuuden tasoon vaikuttavista tekijöistä on solususpension jäähdytysnopeus, erityisesti kiteytysvaiheen aikana. Ohjelmistopohjainen lähestymistapa pakastusnopeuden ja -ajan ongelman ratkaisemiseksi tarjoaa loistavia mahdollisuuksia luoda yksinkertaisia ja erittäin tehokkaita kryosäilytysmenetelmiä ilman, että solususpensiota tarvitsee pestä kryosuojaimista ennen siirtoa.

Solujen elinkelpoisuuden kannalta vaarallisimmat vaiheet niiden valmistuksen aikana ovat suoran pakastuksen ja sulatuksen vaiheet. Hematopoieettisia soluja pakastettaessa merkittävä osa niistä voi tuhoutua solujen välisen väliaineen siirtyessä nesteestä kiinteään faasiin - kiteytyessä. Solukuoleman prosenttiosuuden vähentämiseksi käytetään kryosuojia, joiden vaikutusmekanismeja ja kryosuojaavaa tehokkuutta käsitellään riittävästi tieteellisessä kirjallisuudessa.

Lupaava suunta luuytimen ja napanuoran verisolujen kryosäilytysmenetelmien optimoinnille on useiden eri vaikutusmekanismeja omaavien kryosuojien alhaisten pitoisuuksien yhdistäminen yhteen liuokseen, esimerkiksi solunsisäisesti vaikuttava DMSO ja solunulkoinen suojaava vaikutus omaava hydroksietyylitärkkelys tai albumiini.

Napanuoraveren solujen kryosäilytykseen käytetään perinteisesti 20-prosenttista DMSO-liuosta, joka kaadetaan hitaasti solususpensioon jatkuvasti mekaanisesti sekoittaen jäähauteessa, kunnes kryosuoja-aineen ja solususpension tilavuuksien suhde on sama (1:1). Dimetyylisulfoksidin lopullinen pitoisuus on 10 %. Sitten solususpensio jäähdytetään ohjelmoidussa kryogeenisessä yksikössä nopeudella GS/min -40 °C:seen, minkä jälkeen jäähdytysnopeutta nostetaan 10 °C:seen/min. Kun -100 °C on saavutettu, solususpensiota sisältävä säiliö asetetaan nestemäiseen typpeen (-196 °C). Tällä kryosäilytystekniikalla toiminnallisesti aktiivisten mononukleaaristen solujen säilyvyys sulatuksen jälkeen saavuttaa 85 % alkuperäisestä tasosta.

Kryosäilytysmenetelmien modifikaatioilla pyritään vähentämään DMSO:n pitoisuutta lisäämällä hydroksietyylitärkkelystä (dimetyylisulfoksidin ja hydroksietyylitärkkelyksen lopulliset pitoisuudet ovat vastaavasti 5 ja 6 %). Tällaisen kryosuojainten yhdistelmän korkea tehokkuus havaitaan myeloidisolujen suspension jäädyttämisessä, ja sytoprotektio on yhtä hyvä kuin käytettäessä vain 10-prosenttista dimetyylisulfoksidiliuosta. Elinkelpoisten tumallisten solujen määrä saavutti 96,7 % alkuperäisestä tasosta, ja niiden toiminnallinen aktiivisuus, arvioituna CFU-GM:n lukumäärän perusteella, oli 81,8 %.

Kun dimetyylisulfoksidiliuosta käytettiin 5–10 %:n pitoisuuksina yhdessä 4 %:n hydroksietyylitärkkelyksen (loppupitoisuus) kanssa, havaittiin, että CD34-positiivisten solujen turvallisuus tällaisilla dimetyylisulfoksidipitoisuuksilla pysyy käytännössä muuttumattomana. Samanaikaisesti, kun dimetyylisulfoksidin pitoisuus laskee 5 %:sta 2,5 %:iin, havaitaan napanuoran veren solujen massiivinen kuolema – elinkelpoisten soluyksiköiden määrä laskee 85,4 %:sta 12,2 %:iin. Myös muut kirjoittajat ovat tulleet siihen tulokseen, että 5 ja 10 %:n dimetyylisulfoksidiliuokset (kirjoittajan versiossa yhdessä autologisen seerumin kanssa) tarjoavat maksimaalisen tehokkaan sytoprotektion napanuoran veren HSC-solujen kryosäilytyksen aikana. Lisäksi 5 tai 10 %:n dimetyylisulfoksidin ja 4 %:n hydroksietyylitärkkelysliuoksen yhdistelmällä havaitaan peräkkäin pakastettujen ja sulatettujen solujen korkea säilyvyys, erityisesti kontrolloidulla jäähdytysnopeudella GS/min. Toisessa tutkimuksessa käytettiin kryosuojaavaa liuosta, joka koostui kolmesta ainesosasta – DMSO:sta, puhdistetusta ihmisalbumiinista ja RPMI-elatusaineesta suhteessa 1:4:5 – ja lisättiin solususpensioon samassa tilavuussuhteessa (dimetyylisulfoksidin lopullinen pitoisuus oli 5 %). Sulatuksen jälkeen vesihauteessa +4 GS:n lämpötilassa CFU-GM:n säilyvyys ylitti 94 %.

Jotkut kirjoittajat ehdottavat fraktioimattoman napanuoraveren käyttöä kryosäilytykseen, koska merkittäviä määriä hematopoieettisia soluja menetetään punasolujen poistoprosessin aikana. Tässä muunnelmassa käytetään 10-prosenttista dimetyylisulfoksidiliuosta suojaamaan mononukleaarisia soluja kryokiteyttämisen haitallisilta vaikutuksilta. Pakastus suoritetaan vakiojäähdytysnopeudella GS/min -80 °C:seen, minkä jälkeen napanuoraveren solususpensio lasketaan nestemäiseen typpeen. Tämä pakastusmenetelmä johtaa punasolujen osittaiseen lyysiin, joten verinäytteitä ei tarvitse fraktioida. Sulatuksen jälkeen solususpensio pestään vapaasta hemoglobiinista ja dimetyylisulfoksidista ihmisen albumiiniliuoksessa tai potilaan autologisessa veriseerumissa ja käytetään elinsiirtoon.

Hematopoieettisten kantasolujen säilyvyys sulatuksen jälkeen fraktioimattomassa napanuoraveressä on kyllä parempi kuin fraktioidussa napanuoraveressä, mutta joidenkin punasolujen kryosysteerin kryosäilön vuoksi ABO-yhteensopimattomien punasolujen siirrossa voi ilmetä vakavia verensiirron jälkeisiä ongelmia. Lisäksi varastoidun fraktioimattoman veren tilavuus kasvaa merkittävästi. Kliinisestä näkökulmasta aiemmin eristettyjen ja muista solufraktioista puhdistettujen napanuoraveren hematopoieettisten solujen kryosäilytys on edelleen edullista.

Erityisesti on kehitetty menetelmä fraktioitujen napanuoraverisolujen kryosäilytykseen, joka mahdollistaa punasolujen poistamisen pakastusta edeltävässä vaiheessa, jossa plasmankorvikeliuoksen "Stabizol" osana käytetään 6-prosenttista hydroksietyylitärkkelysliuosta. Sulatuksen jälkeen tällä tavalla saatu solususpensio on valmis kliiniseen käyttöön ilman lisäkäsittelyjä.

Näin ollen napanuoraveren kryosäilytykseen on tällä hetkellä olemassa monia varsin tehokkaita menetelmiä. Niiden perustavanlaatuinen ero on se, että verinäytteet pakastetaan fraktioimattomina tai ne erotellaan solufraktioiksi valmistusvaiheessa ja valmistetaan tumallisia soluja ilman punasolujen lisäystä.

Napanuoraveren hematopoieettisten kantasolujen siirto

1980-luvun lopulla ja 1990-luvun alussa todettiin, että napanuoraveressä, joka ylläpitää sikiön elämää raskauden aikana, on runsaasti hematopoieettisia kantasoluja. Napanuoraverisolujen hankkimisen suhteellinen yksinkertaisuus ja ilmeisten eettisten ongelmien puuttuminen myötävaikuttivat napanuoraveren kantasolujen käyttöön käytännön lääketieteessä. Ensimmäinen onnistunut napanuoraveren siirto Fanconin anemiaa sairastavalle lapselle toimi lähtökohtana napanuoraveren kantasolusiirtojen määrän laajentamiselle ja niiden pankkijärjestelmän luomiselle. Maailman napanuoraveripankkijärjestelmässä suurin on New Yorkin istukan verikeskus, joka on Yhdysvaltain kansallisen terveysinstituutin taseessa. Tässä pankissa säilytettyjen napanuoraverinäytteiden määrä lähestyy 20 000:ta. Myös onnistuneen siirron läpikäyneiden vastaanottajien (pääasiassa lasten) määrä kasvaa. Yhdysvaltain terveysministeriön mukaan napanuoraverensiirron saaneiden uusiutumisvapaa aika elinsiirron jälkeen on jo yli 10 vuotta.

Tämä ei ole yllättävää, sillä lukuisat napanuoraveren hematopoieettista potentiaalia koskevat tutkimukset ovat osoittaneet, että varhaisimpien kantasolujen määrän ja laadun suhteen se ei ole ainoastaan aikuisen luuydintä huonompi, vaan jopa ylittää sen joiltakin osin. Napanuoraveren kantasolujen korkeampi proliferatiivisen potentiaalin syynä ovat solusignaloinnin ontogeneettiset piirteet, spesifisten kasvutekijöiden reseptorien läsnäolo kantasoluissa, napanuoraveren solujen kyky tuottaa autokriinisesti kasvutekijöitä sekä telomeerien suuri koko ja pituus.

Näin ollen napanuoraverestä peräisin olevien hematopoieettisten kantasolujen genomiset ja fenotyyppiset ominaisuudet määräävät siirteen korkealaatuisen kiinnittymisen ja suuren potentiaalin luovuttajan hematopoieesin palautumiselle vastaanottajan kehossa.

Napanuoraveren hematopoieettisten kantasolujen hyödyt

Napanuoraverestä peräisin olevien hematopoieettisten kantasolujen käytön todellisista eduista muihin hematopoieettisten solujen lähteisiin verrattuna on syytä huomata käytännössä olematon riski luovuttajan terveydelle (jos istukkaa ei oteta huomioon sellaisenaan) ja yleisanestesian tarpeen puuttuminen. Napanuoraveren käyttö laajentaa solusiirtomahdollisuuksia osittain HLA-yhteensopivien siirtojen ansiosta (yhteensopimattomuus yhdestä kolmeen antigeeniin). On kehitetty menetelmä napanuoraverestä peräisin olevien hematopoieettisten solujen pitkäaikaiseen säilytykseen pakastettuna, mikä lisää harvinaisten HLA-tyyppien saamisen todennäköisyyttä ja lyhentää HLA-yhteensopivan siirteen etsimiseen kuluvaa aikaa allogeenista siirtoa varten. Samalla tiettyjen tarttuvien piilevien infektioiden riski pienenee merkittävästi. Lisäksi napanuoraveren solujen käyttö autologisessa siirrossa tarjoaa edullisen biologisen henkivakuutuksen.

Istukkasta kerättävien verimäärien pienten määrien (keskimäärin enintään 100 ml) vuoksi napanuoran laskimosta saatavan verimäärän maksimaalinen saanti korostuu samalla, kun napanuoran verinäytteiden bakteerikontaminaation riskiä minimoidaan.

Napanuoraveren primitiiviset hematopoieettiset solut tunnistetaan yleensä niiden pinnalla olevan CD34-glykofosfoproteiinin perusteella sekä niiden toiminnallisten ominaisuuksien perusteella tutkimalla klonogeenisyyttä tai pesäkkeiden muodostumista in vitro. Vertaileva analyysi osoitti, että napanuoraveressä ja luuytimessä CD34-positiivisten solujen enimmäispitoisuus mononukleaarisessa fraktiossa on vastaavasti 1,6 ja 5,0 %, pesäkkeitä muodostavien yksiköiden enimmäistaso CD34+-solupopulaatiossa on 80 ja 25 %, CD34+-solujen kokonaiskloonaustehokkuus on 88 ja 58 %, ja korkean proliferaatiopotentiaalin omaavien pesäkkeitä muodostavien solujen (HPP-CFC CD34+-populaatiossa) enimmäispitoisuus on 50 ja 6,5 %. On lisättävä, että CD34+CD38-solujen kloonaustehokkuus ja kyky reagoida sytokiinien stimulaatioon ovat myös korkeampia napanuoraveren hematopoieettisissa kantasoluissa.

Fenotyyppisten antigeenien Thy-1, CD34 ja CD45RA yhdistelmä vahvistaa napanuoraveren hematopoieettisten solujen korkean lisääntymispotentiaalin, ja näiden kolmen antigeenin ilmentyminen napanuoraveren solujen pinnalla viittaa niiden kuulumiseen kantasoluihin. Lisäksi havaittiin, että napanuoraveressä on CD34+-fenotyypin omaavia soluja, joilla ei ole lineaarisen erilaistumisen markkereita. Fenotyyppiprofiilin CD34+/Lin omaavien solupopulaatioiden taso napanuoraveressä on noin 1 % CD34-positiivisten solujen kokonaismäärästä. Napanuoraveren hematopoieettiset progenitorisolut synnyttävät sekä lymfoidisolulinjan että lineaarisen soluerilaistumisen pluripotentin myeloidisen sarjan, mikä myös osoittaa niiden kuulumisen kantasoluihin.

Kuten jo mainittiin, luuytimen ja napanuoraveren välillä on merkittäviä eroja yhden keräyskerran aikana saatujen hematopoieettisten solujen määrässä. Jos luuytimensiirrossa solumassan menetys erottelun, kryosäilytyksen, sulatuksen ja testauksen aikana on hyväksyttävä 40–50 %, niin napanuoraveressä tällaiset soluhäviöt ovat erittäin merkittäviä, koska jos käytetään riittämätöntä määrää HSC-soluja, siirto voi osoittautua tehottomaksi. G. Koglerin ym. (1998) mukaan solunsiirrossa, kun vastaanottajan paino on 10 kg, kaikki napanuoraverinäytteet voivat olla potentiaalisia siirteitä (kerättyjen napanuoraverinäytteiden kokonaismäärä on 2098), 35 kg:n painoisilla potilailla - 67 %, ja vain 25 % näytteistä voi tarjota tehokkaan siirron potilailla, joiden paino on 50–70 kg. Tämä kliininen tilanne osoittaa tarpeen optimoida ja parantaa olemassa olevien napanuoraverisolujen keräys-, lisääntymis- ja säilytysmenetelmien tehokkuutta. Siksi kirjallisuudessa käsitellään tällä hetkellä laajasti napanuoraveren keräämis-, testaus-, erottelu- ja kryosäilytysmenetelmien standardointikysymyksiä veripankkien luomiseksi, sen käyttöä kliinisessä ympäristössä ja siinä määritellään myös napanuoraveren hematopoieettisten kantasolujen säilytysehdot ja -ehdot.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Napanuoraveren hematopoieettisten kantasolujen käyttö lääketieteessä

Napanuoraverestä ^{on yleensä mahdollista eristää jopa 106 hematopoieettista kantasolua, harvoin enempää. Tässä suhteessa kysymys siitä, riittääkö tällainen määrä napanuoraverestä peräisin olevia hematopoieettisia soluja palauttamaan hematopoieesin aikuisella vastaanottajalla, on edelleen avoin. Mielipiteet tästä asiasta jakautuvat. Jotkut tutkijat uskovat, että tällainen määrä on täysin riittävä lasten elinsiirtoon, mutta liian pieni aikuiselle elinsiirtoon, jolle optimaalinen määrä on (7-10) x106} CD34-positiivisen solun lisääminen painokiloa kohden - keskimäärin 7 x 108 ^elinsiirtoa kohden. Näistä laskelmista seuraa, että yksi napanuoraverinäyte sisältää 700 kertaa vähemmän hematopoieettisia kantasoluja kuin tarvitaan yhteen elinsiirtoon aikuiselle potilaalle. Tällainen kvantitatiivinen arviointi tehdään kuitenkin analogisesti siirrettyjen luuydinsolujen lukumäärän kanssa eikä siinä oteta lainkaan huomioon hematopoieesin ontogeneettisiä piirteitä.

Erityisesti jätetään huomiotta se tosiasia, että napanuoraverestä peräisin olevilla hematopoieettisilla kantasoluilla on suurempi proliferatiivisen potentiaalin verrattuna luuytimen hematopoieettisiin progenitorisoluihin. In vitro -pesäkkeiden muodostuspotentiaalia koskevien tutkimusten tulokset viittaavat siihen, että yksi napanuoraveren annos pystyy palauttamaan aikuisen vastaanottajan hematopoieesin. Toisaalta ei pidä unohtaa, että napanuoraveren kantasolujen määrä vähenee jo alkionkehityksen aikana: CD34-positiivisten solujen pitoisuus napanuoraveressä vähenee lineaarisesti viisinkertaisesti 20. raskausviikosta (tutkimuksen veri otettiin raskauden ennenaikaisen keskeyttämisen aikana) 40. raskausviikkoon (fysiologisen synnytyksen aika) välisenä aikana, johon liittyy rinnakkainen, pysyvästi kasvava lineaaristen sytodifferentiaatiomarkkereiden ilmentyminen.

Koska napanuoraverinäytteiden progenitorisolujen kvantitatiiviseen määritykseen ei ole standardoitua lähestymistapaa, keskustelut napanuoraverestä saatavien hematopoieettisten kantasolujen optimaalisesta annoksesta jatkuvat. Jotkut tutkijat uskovat, että vastaanottajan painoon laskettua tumallisten ja mononukleaaristen solujen määrää eli niiden annosta voidaan käyttää kriteereinä napanuoraverinäytteiden valinnassa. Jotkut kirjoittajat uskovat, että CD34+-solujen vähimmäiskvantitatiivinen kynnys jopa kantasolujen autotransplantaatiota varten on 2 x 106 ^/ kg. Samalla hematopoieettisten solujen annoksen nostaminen 5 x 106 ^soluun /kg (vain 2,5-kertainen) varmistaa jo suotuisamman kulun varhaisessa elinsiirron jälkeisessä vaiheessa, vähentää infektiokomplikaatioiden esiintyvyyttä ja lyhentää ennaltaehkäisevän antibioottihoidon kestoa.

E. Gluckmanin ym. (1998) mukaan onkohematologiassa onnistuneen napanuoraverensiirron ehtona on vähintään 3,7 x 107 ^tumallista solua per 1 kg vastaanottajan painoa. Kun hematopoieettisten kantasolujen annos pienennetään 1 x 107 ^tai vähempään tumallista solua per 1 kg potilaan painoa, siirteen epäonnistumisen ja verisyövän uusiutumisen riski kasvaa jyrkästi. On ymmärrettävä, että kantasolujen vähimmäismäärää, joka tarvitaan hematopoieesin nopeaan palautumiseen HSC-solujen allotransplantaation jälkeen, ei vielä tunneta. Teoriassa tämä voidaan saavuttaa käyttämällä yhtä solua, mutta luuydinsiirron kliinisessä käytännössä nopea ja vakaa kiinnittyminen taataan siirtämällä vähintään (1-3) x 108 tumallista ^solua per 1 kg potilaan painoa.

Äskettäin tehdyssä yksityiskohtaisessa tutkimuksessa, jossa määritettiin optimaalinen HSC-määrä onkohematologiassa, potilaita seurattiin kolmessa ryhmässä, jotka jaettiin siirretyn materiaalin CD34-positiivisten solujen pitoisuuden mukaan. Ensimmäisen ryhmän potilaille annettiin (3–5) x 106 ^solua /kg. Toisen ryhmän potilaiden HSC-annos oli (5–10) x 106 ^solua /kg, ja kolmannen ryhmän potilaille siirrettiin yli 10 x 106 ^CD34 +-solua/kg. Parhaat tulokset havaittiin vastaanottajaryhmässä, jotka saivat siirteen, jossa CD34-positiivisten solujen määrä oli (3–5) x 106 ^/ kg. Siirrettyjen solujen annoksen nostamisella yli 5 x 106 ^/ kg ei havaittu tilastollisesti merkitseviä etuja. Tässä tapauksessa erittäin korkea HSC-pitoisuus siirteessä (> 10 x 106 ^/ kg) liittyy merkittävän määrän jäännöskasvainsolujen takaisinperfuusioon, mikä johtaa taudin uusiutumiseen. Siirrettyjen allogeenisten progenitorisolujen lukumäärän ja käänteishyljintäreaktion kehittymisen välillä ei ole vahvistettu suoraa yhteyttä.

Maailmanlaajuinen kokemus napanuoraverensiirroista vahvistaa niiden suuren uudelleenpopulaatiopotentiaalin. Napanuoraverisiirteen kiinnittymisaste korreloi siirrettyjen tumallisten solujen määrän kanssa. Parhaat tulokset havaitaan 3 x 107/kg siirrolla ^, kun taas luuytimessä tämä annos on 2 x 108 ^/ kg. Koordinointikeskusten tietojen mukaan vuoden 2000 lopussa maailmanlaajuisesti tehtiin 1200 napanuoraveren solusiirtoa, pääasiassa sukulaisluovuttajilta (83 %). On selvää, että napanuoraverta tulisi harkita luuytimen vaihtoehtona hemoblastoosipotilaiden siirroissa.

Samaan aikaan hematopoieettisen kudoksen lähteen vastasyntyneisyys herättää optimismia sen HSC:n toiminnallisten piirteiden vuoksi. Samaan aikaan vain kliininen kokemus voi vastata kysymykseen yhden napanuoraverinäytteen riittävyydestä hematopoieesin palauttamiseksi aikuisella vastaanottajalla, jolla on hematopoieettinen aplasia. Napanuoraverisolujen siirtoa käytetään hoito-ohjelmissa moniin kasvain- ja ei-kasvainsairauksiin: leukemia ja myelodysplastiset oireyhtymät, non-Hodgkinin lymfooma ja neuroblastooma, aplastinen anemia, synnynnäiset Fanconin ja Diamond-Blackfanin anemiat, leukosyyttien adheesiopuutos, Barrin oireyhtymä, Guntherin tauti, Hurlerin oireyhtymä, talassemia.

Napanuoraverestä peräisin olevien hematopoieettisten solujen siirron immunologiset näkökohdat ansaitsevat tarkempaa huomiota ja erillisen tutkimuksen. On osoitettu, että napanuoraverestä peräisin olevien kantasolujen siirron tapauksissa luovuttajilta, joilla on epätäydellinen HLA-yhteensopivuus, siirtotulokset ovat varsin tyydyttäviä, mikä kirjoittajien mukaan viittaa napanuoraveren solujen alhaisempaan immunoreaktiivisuuteen kuin luuytimessä.

Napanuoraveren solukoostumuksen yksityiskohtainen tutkimus paljasti sekä immuunijärjestelmän efektorisolujen fenotyyppisen kirjon että niiden toiminnallisen aktiivisuuden piirteet, jotka mahdollistivat napanuoraveren pitämisen HSC-lähteenä, jolla on suhteellisen pieni riski sairastua siirrännäisreaktioon. Napanuoraveren immunokompetenttien solujen toiminnallisen kypsymättömyyden merkeistä on huomattava sytokiinien tuotannon epätasapaino ja immuunivasteen sytokiinisäätelyn herkkyyden väheneminen. Tästä johtuvaa sytotoksisten lymfosyyttien aktiivisuuden estymistä pidetään tekijänä, joka edistää immunologisen toleranssin muodostumista siirrettyä hematopoieettista kudosta kohtaan. Napanuoraveren lymfosyyttipopulaatiossa, toisin kuin aikuisten luovuttajien ääreisveressä ja luuytimessä, inaktiiviset, epäkypsät lymfosyytit ja suppressorisolut ovat vallitsevia. Tämä osoittaa napanuoraveren T-lymfosyyttien heikentynyttä valmiutta immuunivasteeseen. Napanuoraveren monosyyttipopulaation tärkeä piirre on toiminnallisesti täysimittaisten ja aktiivisten antigeenia esittelevien solujen alhainen pitoisuus.

Toisaalta napanuoraveren immuunijärjestelmän efektorisolujen alhainen kypsyysaste laajentaa niiden kliinistä käyttöaiheita, koska nämä ominaisuudet vähentävät luovuttajan ja vastaanottajan solujen välisen immuunikonfliktin voimakkuutta. Mutta toisaalta tiedetään, että "graft versus host" -reaktion kehittymisasteen ja siirteen kasvaimia torjuvan vaikutuksen, eli "graft versus leukemia" -vaikutuksen, kehittymisen välillä on korrelaatio. Tässä yhteydessä tehtiin tutkimus napanuoraveren solujen kasvaimia torjuvasta sytotoksisuudesta. Saadut tulokset osoittavat, että immunokompetenttien napanuoraveren solujen todella heikentyneestä vasteesta antigeenistimulaatioon huolimatta ensisijaisesti aktivoituvat lymfosyytit ovat luonnollisia tappajasoluja ja tappajan kaltaisia soluja, jotka osallistuvat aktiivisesti kasvaimia torjuvan sytotoksisuuden toteutumismekanismeihin. Lisäksi napanuoraverestä löydettiin CD16+CD56+- ja CD16"TCRa/p+ -fenotyyppien lymfosyyttien alaryhmiä. Oletetaan, että nämä solut aktivoituneessa muodossaan toteuttavat "graft versus leukemia" -reaktion.

Ukrainan lääketieteellisen akatemian onkologian laitoksella annettiin kryosäilytettyjä napanuoraveren hematopoieettisia soluja syöpäpotilaille, joilla oli kemoterapia- ja sädehoidon aiheuttama pysyvä hematopoieettisten kantasolujen vajaatoiminta. Näillä potilailla napanuoraveren hematopoieettisten kantasolujen siirto palautti varsin tehokkaasti heikentyneen hematopoieesin, mistä on osoituksena kypsien, muodostuneiden elementtien pitoisuuden pysyvä nousu ääreisveressä sekä solu- ja humoraalisen immuniteetin tilaa kuvaavien indikaattoreiden nousu. Napanuoraveren hematopoieettisten solujen siirron jälkeisen uudelleenpopulaation vakaa vaikutus mahdollistaa sädehoidon ja kemoterapian jatkamisen keskeyttämättä hoitoa. On tietoa napanuoraveren kantasolujen allotransplantaation korkeammasta tehokkuudesta onkohematologisille potilaille: kasvaintaudin uusiutumisriski niitä käytettäessä oli 25 % verrattuna 40 %:iin potilailla, joille siirrettiin allogeeninen luuydin.

Kryosäilytettyjen napanuoraveren kantasolujen vaikutusmekanismia tulisi pitää vastaanottajan hematopoieesin humoraalisen stimulaation tuloksena, joka johtuu vastasyntyneiden solujen ainutlaatuisesta kyvystä autokriinisesti tuottaa hematopoieettisia kasvutekijöitä, sekä luovuttajasolujen tilapäisen kiinnittymisen seurauksena (mistä on osoituksena sikiön hemoglobiinipitoisuuden luotettava nousu vastaanottajien ääreisveressä 7–15. päivänä verensiirron jälkeen verrattuna alkuperäisiin tietoihin). Verensiirron jälkeisten reaktioiden puuttuminen napanuoraveren vastaanottajilla on seurausta sen immunokompetenttien solujen suhteellisesta sietokyvystä sekä luottamuskriteeri kryosäilytetyn materiaalin biologiselle riittävyydelle.

Napanuoraveren T-lymfosyyttien tappajasolut kykenevät aktivoitumaan eksogeenisen sytokiinistimulaation vaikutuksesta, mitä käytetään uusien ex vivo- ja in vivo -menetelmien kehittämiseen siirrännäislymfoidielementtien kasvaimia hillitsevän sytotoksisuuden indusoimiseksi myöhempää immunoterapiaa varten. Lisäksi napanuoraveren immunokompetenttien solujen genomin "epäkypsyys" mahdollistaa niiden käytön kasvaimia hillitsevän aktiivisuuden tehostamiseksi molekyylimallinnusmenetelmillä.

Nykyään napanuoraverestä on löydetty laaja käyttökohde, pääasiassa lasten hematologiassa. Akuuttia leukemiaa sairastavilla lapsilla napanuoraveren hematopoieettisten kantasolujen allotransplantaatio vähentää merkittävästi käänteishyljintäreaktion ilmaantuvuutta verrattuna luuytimen allotransplantaatioon. Tähän liittyy kuitenkin pidempi neutro- ja trombosytopeniajakso ja valitettavasti korkeampi 100 päivän kuolleisuus siirron jälkeen. Granulosyytti- ja verihiutaletasojen pidempi palautumisaika ääreisveressä voi johtua CD34-positiivisten napanuoraveren solujen yksittäisten alaryhmien riittämättömästä erilaistumisesta, mistä on osoituksena radioaktiivisen rodamiinin alhainen imeytymistaso ja CD38-antigeenien alhainen ilmentyminen niiden pinnalla.

Samaan aikaan aikuispotilaille tehdyissä napanuoraverestä otettujen hematopoieettisten kantasolujen siirroissa, jotka tehtiin sekä yhteensopivan, ei-toissijaisen luuydinluovuttajan että autologisten HSC-solujen mobilisointimahdollisuuden puuttuessa, alle 30-vuotiaiden potilasryhmässä havaittiin korkea vuoden uusiutumisvapaa eloonjäämisaste (73 %). Vastaanottajien ikäryhmän laajentaminen (18–46 vuotta) johti eloonjäämisasteen laskuun 53 prosenttiin.

Luuytimessä ja napanuoraveressä tutkittujen CD34+-fenotyypin solujen kvantitatiivinen analyysi paljasti niiden korkeamman (3,5-kertaisen) pitoisuuden luuytimessä, mutta napanuoraveressä havaittiin merkittävä fenotyyppiprofiilin CD34+HLA-DR omaavien solujen enemmistö. Tiedetään, että immunologisia markkereita CD34+HLA-DR omaavat verisolut lisääntyvät aktiivisemmin kuin immunofenotyypin CD34+HLA-DR+ omaavat solut, mikä vahvistettiin pitkäaikaisten hematopoieettisten soluviljelmien kasvun kokeellisissa tutkimuksissa in vitro. Primitiivisiä solujen esiasteita, joilla on CD34+CD38-fenotyyppi, on sekä napanuoraveressä että luuytimessä, mutta merkkiaineella CD34+CD38 varustetuilla napanuoraveren soluilla on korkeampi klonogeeninen aktiivisuus kuin saman fenotyypin omaavilla hematopoieettisilla soluilla, jotka on eristetty aikuisten luovuttajien luuytimestä. Lisäksi CD34+CD38-immunofenotyypin omaavat napanuoraveren solut lisääntyvät nopeammin sytokiinien (IL-3, IL-6, G-CSF) stimulaation seurauksena ja tuottavat 7 kertaa enemmän pesäkkeitä pitkäaikaisissa viljelmissä kuin luuydinsolut.

Napanuoraveren kantasolupankit

Uuden käytännön lääketieteen alueen - napanuoraveren kantasolusiirron - asianmukaisen kehityksen sekä luuytimen hematopoieettisten kantasolusiirtojen toteuttamisen kannalta tarvitaan laaja veripankkiverkosto, jollaisia on jo luotu Yhdysvalloissa ja Euroopassa. Kotimaisia napanuoraveren pankkiverkostoja yhdistää Netcord Bank Association. Kansainvälisen napanuoraveripankkien yhdistyksen perustamisen tarkoituksenmukaisuus johtuu siitä, että toisiinsa liittymättömien siirtojen suorittamiseen tarvitaan suuri määrä tyypitettyjä napanuoraverinäytteitä, mikä mahdollistaa HLA-identtisen luovuttajan valinnan. Vain sellaisen pankkijärjestelmän perustaminen, jossa säilytetään eri HLA-tyyppien verinäytteitä, voi todella ratkaista tarvittavan luovuttajan löytämisen ongelman. Tällaisen napanuoraveripankkijärjestelmän organisointi edellyttää eettisten ja oikeudellisten normien alustavaa kehittämistä, joista keskustellaan parhaillaan kansainvälisellä tasolla.

Napanuoraveripankkien perustamiseksi Ukrainaan on laadittava joukko säädöksiä ja asiakirjoja.

Ensinnäkin nämä ovat napanuoraveren keräys-, fraktiointi- ja pakastusmenetelmien standardointikysymyksiä. Synnytyssairaaloissa tapahtuvan napanuoraveren keräämisen sääntöjä on säänneltävä lääketieteellisen etiikan vaatimusten mukaisesti, jotta voidaan määrittää napanuoraveren vähimmäismäärä, joka varmistaa onnistuneen siirron. On tarpeen vertailla ja standardoida erilaisia kriteerejä hematopoieettisten kantasolujen laadun ja määrän arvioimiseksi sekä HLA-tyypitysmenetelmiä ja diagnostisia menetelmiä napanuoraveren solujen infuusion aikana tarttuville geneettisille ja tartuntataudeille, jotta voidaan laatia yhteiset kriteerit terveiden luovuttajien valinnalle. On myös syytä keskustella erillisten varastotilojen luomisesta napanuoraverestä saadulle seerumille, soluille ja DNA:lle.

On ehdottoman välttämätöntä järjestää napanuoraveren tietojen tietokoneverkko, joka voidaan yhdistää luuydinluovutusrekistereihin. Solutransplantologian jatkokehittämiseksi on tarpeen kehittää erityisiä protokollia HLA-identtisten sukulaisten ja ei-sukupuolisten luovuttajien napanuoraveren ja luuydinsiirron tulosten vertailemiseksi. Dokumentaation standardointi, mukaan lukien vanhempien tietoinen suostumus sekä äidin tai sukulaisten ilmoittaminen lapsella havaituista perinnöllisistä ja/tai tartuntataudeista, voi auttaa ratkaisemaan napanuoraveren solujen kliiniseen käyttöön liittyviä eettisiä ja oikeudellisia ongelmia.

Solujensiirtotekniikan kehityksen ratkaiseva edellytys Ukrainassa on kansallisen kantasoluluovutusohjelman käyttöönotto ja kansainvälisen yhteistyön kehittäminen muiden maiden kanssa Maailman luuydinluovutusjärjestön (WMDA), Yhdysvaltain kansallisen luuydinluovutusohjelman (NMDP) ja muiden rekistereiden kautta.

Yhteenvetona napanuoraverestä peräisin olevien hematopoieettisten kantasolujen siirron vielä lyhyestä kehityshistoriasta toteamme, että ensimmäiset oletukset napanuoraveren käyttömahdollisuudesta kliinisessä käytössä, jotka esitettiin jo 70-luvun alussa, vahvistettiin 80-luvulla eläinkokeilla tehtyjen kokeellisten tutkimusten tuloksilla, ja vuonna 1988 tehtiin maailman ensimmäinen napanuoraverestä peräisin olevien hematopoieettisten solujen siirto ihmiselle, minkä jälkeen alettiin luoda maailmanlaajuinen napanuoraveripankkien verkosto. Kymmenessä vuodessa napanuoraverestä peräisin olevia hematopoieettisia soluja siirrettyjen potilaiden määrä lähestyi 800:aa. Heidän joukossaan oli potilaita, joilla oli erilaisia kasvainsairauksia (leukemia, lymfooma, kiinteät kasvaimet) ja ei-kasvaimeton sairauksia (synnynnäiset immuunipuutokset, anemia, aineenvaihduntahäiriöihin liittyvät sairaudet).

Napanuoraveren varhaisten ja sitoutuneiden solujen esiasteiden pitoisuus on suurempi kuin aikuisen ääreisveressä. Granulosyytti-makrofagipesäkkeitä muodostavien yksiköiden lukumäärän ja niiden proliferatiivisen potentiaalin suhteen napanuoraveri ylittää merkittävästi aikuisten ääreisveren, jopa kasvutekijöiden lisäämisen jälkeen. Pitkäaikaisissa soluviljelmissä in vitro on havaittu napanuoraveren solujen suurempaa proliferatiivista aktiivisuutta ja elinkykyä kuin luuydinsoluilla. Napanuoraveren kantasolusiirrossa kriittisiä hetkiä ovat tumallisten solujen lukumäärä ja hematopoieettinen potentiaali, sytomegalovirusinfektion esiintyminen, luovuttajan ja vastaanottajan HLA-yhteensopivuus sekä potilaan paino ja ikä.

Napanuoraveren kantasolusiirtoa tulisi kuitenkin harkita luuydinsiirron vaihtoehtona vakavien verisairauksien hoidossa, pääasiassa lapsilla. Napanuoraveren solujen siirron kliinisiä ongelmia ollaan vähitellen ratkaisemassa - napanuoraveren solujen keräämiseen, erotteluun ja kryosäilytykseen on jo olemassa varsin tehokkaita menetelmiä, napanuoraveren pankkien muodostamiselle tarjotaan olosuhteita ja tumallisten solujen testausmenetelmiä parannetaan. 3 % gelatiiniliuosta ja 6 % hydroksietyylitärkkelysliuosta tulisi pitää optimaalisina erottelumenetelminä napanuoraveren hematopoieettisten kantasolujen laajamittaisessa hankinnassa pankkeja luotaessa.

P. Perekhrestenko ja yhteistyökumppanit (2001) huomauttavat aivan oikein, että napanuoraveren kantasolusiirron tulisi ottaa ansaitsemansa paikkansa osana hoitotoimenpiteitä, joilla voidaan voittaa eri syistä johtuvat hematopoieettiset lamaannukset, koska napanuoraveren kantasoluilla on useita merkittäviä etuja, joista tärkeimpiä ovat niiden hankinnan suhteellinen yksinkertaisuus, luovuttajalle aiheutuvan riskin puuttuminen, vastasyntyneiden solujen vähäinen viruskontaminaatio ja siirron suhteellisen alhaiset kustannukset. Jotkut kirjoittajat huomauttavat, että napanuoraveren siirtoon liittyy harvemmin käänteishyljintäreaktioon liittyviä komplikaatioita kuin luuydinsiirtoon, mikä johtuu heidän mielestään HLA-DR-antigeenien heikosta ilmentymisestä napanuoraveren soluissa ja niiden kypsymättömyydestä. Napanuoraveren ydinsolujen pääpopulaatio on kuitenkin T-lymfosyytit (CD3-positiiviset solut), joiden pitoisuus on noin 50 %, mikä on 20 % vähemmän kuin aikuisen perifeerisessä veressä, mutta fenotyyppiset erot T-solujen alaryhmissä näistä lähteistä ovat merkityksettömiä.

Napanuoraveren kantasolusiirron eloonjäämisasteeseen suoraan vaikuttavista tekijöistä on syytä huomata potilaiden ikä (parhaat tulokset havaitaan 1–5-vuotiailla vastaanottajilla), taudin varhainen diagnosointi ja leukemian muoto (tehokkuus on merkittävästi korkeampi akuutissa leukemiassa). Suuri merkitys on tumallisten napanuoraveren solujen annoksella sekä niiden HLA-yhteensopivuudella vastaanottajan kanssa. Ei ole sattumaa, että napanuoraveren kantasolusiirron kliinisen tehokkuuden analyysi onkohematologiassa osoittaa parhaat hoitotulokset käytettäessä sukulaisperäisiä siirteitä: vuoden uusiutumisvapaa eloonjäämisaika on tässä tapauksessa 63 %, kun taas sukulaisperäisissä siirteissä se on vain 29 %.

Näin ollen suuri määrä kantasoluja napanuoraveressä ja vastasyntyneiden hematopoieettisten kantasolujen korkea uusiutumiskapasiteetti mahdollistavat niiden käytön allogeeniseen siirtoon onkohematologisilla potilailla. On kuitenkin huomattava, että hematopoieesin palautuminen napanuoraveren hematopoieettisten solujen siirron jälkeen on "ajallisesti venytetty": neutrofiilipitoisuuden palautuminen perifeerisessä veressä havaitaan yleensä 6. viikon loppuun mennessä, ja trombosytopenia yleensä häviää 6 kuukauden kuluttua. Lisäksi napanuoraveren hematopoieettisten solujen kypsymättömyys ei sulje pois immunologisia konflikteja: vakavaa akuuttia ja kroonista käänteishyljintäreaktiota havaitaan 23 ja 25 %:lla vastaanottajista. Akuutin leukemian uusiutumista ensimmäisen vuoden loppuun mennessä napanuoraveren solujen siirron jälkeen havaitaan 26 %:lla tapauksista.

[ 10 ], [ 11 ]