Kiteiden merkitys nivelrikon patogeneesissä

Emäksisiä kalsiumfosfaattikiteitä (BCP) löytyy nivelnesteestä 30–60 %:lla nivelrikkopotilaista. A. Swanin ym. (1994) mukaan kalsiumia sisältäviä kiteitä löytyy nivelnesteestä paljon suuremmalla määrällä nivelrikkopotilaita. Kiteiden erittäin pienen koon tai pienen lukumäärän vuoksi niitä ei kuitenkaan tunnisteta perinteisillä tekniikoilla. BCP-kiteiden esiintyminen nivelnesteessä korreloi nivelruston rappeutumisen röntgenkuvissa näkyvien löydösten kanssa ja liittyy suurempaan nestekertymän määrään verrattuna nestekertymään polvinivelissä, joissa ei ole kiteitä. Tutkimus gonartroosin röntgenkuvissa etenemiseen vaikuttavista tekijöistä osoitti, että kalsiumpyrofosfaattidihydraattikiteiden (CPPD) kertyminen ennustaa epäsuotuisaa kliinistä ja radiologista lopputulosta. Iäkkäillä potilailla tehdyssä tutkimuksessa nivelrikon havaittiin liittyvän kondrokalsinoosiin, erityisesti polven lateraalisessa sääri-reisiluuosastossa ja kolmessa ensimmäisessä metakarpofalangeaalinivelessä. Ei ole harvinaista, että molempia kiteitä, OFC ja PFC, löytyy nivelrikkopotilailta.

Kliinisesti kalsiumkiteiden kertymisen aiheuttama nivelruston rappeutuminen eroaa primaarisessa nivelrikossa havaitusta. Jos kiteet olisivat yksinkertainen ruston rappeutumisen epi-ilmiö, niitä esiintyisi primaarisen nivelrikon useimmin vaivaamissa nivelissä, eli polvissa, lonkissa ja käsien pienissä nivelissä. Sitä vastoin kiteiden kertymissairaudet vaikuttavat useimmiten niveliin, jotka eivät ole tyypillisiä primaariselle nivelrikolle, kuten olkapäähän, ranteeseen ja kyynärpäähän. Kiteiden esiintyminen nivelnesteessä (effuusionesteessä) liittyy vakavampaan nivelruston rappeutumiseen. Kysymystä siitä, kumpi on syy ja kumpi seuraus, kiteiden kertymä vai ruston rappeutuminen, on pohdittu. Väliasema on seuraava oletus: primaarinen ruston aineenvaihdunnan poikkeavuus johtaa sen rappeutumiseen, ja kiteiden sekundaarinen kerrostuminen kiihdyttää sen hajoamista (ns. amplifikaatiosilmukkateoria).

Tarkkaa mekanismia, jolla kalsiumkiteet vaurioittavat nivelrustoa, ei tunneta, ja se on tiivistetty alla. Teoriassa kalsiumkiteet voivat vaurioittaa kondrosyyttejä suoraan. Histologinen tutkimus kuitenkin paljastaa harvoin kiteitä kondrosyyttien lähellä, ja vielä harvemmin ne joutuvat kondrosyyttien nielemiksi. Todennäköisin mekanismi on kiteiden fagosytoosi nivelkalvon vuoraussolujen toimesta, mitä seuraa proteolyyttisten entsyymien vapautuminen tai sytokiinien eritys, jotka stimuloivat kondrosyyttien entsyymien vapautumista. Tätä käsitystä tukee tutkimus PFKD:n aiheuttaman niveltulehduksen roolista nopeasti etenevän nivelrikon kehittymisessä pyrofosfaattiartropatiassa. Tässä tutkimuksessa kalsiumpyrofosfaattidihydraattikiteitä (1 tai 10 mg) injektoitiin viikoittain kanien oikeaan polveen, joilla oli osittaisen lateraalisen meniskektomian aiheuttama nivelrikko. Kävi ilmi, että kahdeksan injektion jälkeen oikeassa polvinivelessä havaittiin merkittävästi vakavampia muutoksia verrattuna vasempaan. Nivelkalvon tulehduksen voimakkuus korreloi kalsiumpyrofosfaattidihydraattikiteiden nivelensisäisten injektioiden ja niiden annoksen kanssa. Vaikka tässä tutkimuksessa käytetyt CPPD-kiteiden annokset ylittivät in vivo -annokset, tulokset osoittavat CPPD:n aiheuttaman tulehduksen roolin nivelrikon etenemisessä pyrofosfaattiartropatiassa.

Kalsiumia sisältävien kiteiden nivelrustovaurioiden mahdolliset indusointimekanismit liittyvät niiden mitogeenisiin ominaisuuksiin, kykyyn indusoida MMP:itä ja stimuloida prostaglandiinisynteesiä.

Kalsiumia sisältävien kiteiden mitogeeninen vaikutus. Kiteisiin liittyvissä nivelkalvon limakalvosolujen lisääntymistä havaitaan usein, ja kiteet itse ovat vain osittain vastuussa tästä prosessista. Nivelkalvosolujen määrän kasvuun liittyy sytokiinien erityksen lisääntyminen, jotka edistävät kondrolyysiä ja indusoivat proteolyyttisten entsyymien eritystä. OFC-kiteet ihmisen nivelpatologiassa havaittavilla pitoisuuksilla stimuloivat annosriippuvaisesti lepotilassa olevien ihon fibroblastiviljelmien sekä koiran ja hiiren nivelkalvon fibroblastien mitogeneesiä. Kalsiumpyrofosfaattidihydraatin, uraatin, sulfaatin, karbonaatin ja kalsiumfosfaatin kiteet stimuloivat solujen kasvua. Näiden kiteiden indusoiman ( ^3H )-tymidiinin liittymisen alkamisaika ja huippu siirtyvät 3 tuntia verrattuna solujen stimulointiin veriseerumilla. Tämä ajanjakso voi olla välttämätön fagosytoosille ja kiteiden liukenemiselle. Samankokoisten kontrollikiteiden (esim. timanttipöly tai lateksihiukkaset) lisääminen ei stimuloinut mitogeneesiä. Natriumuraattimonohydraattikiteillä oli heikot mitogeeniset ominaisuudet ja ne olivat merkittävästi heikompia kuin kalsiumuraatilla, mikä osoittaa kiteiden kalsiumpitoisuuden merkityksen mitogeneesissä. Synteettisillä OFC-kiteillä oli samat mitogeeniset ominaisuudet kuin kondrokalsinoosia sairastavilta potilailta saaduilla kiteillä. Kalsiumia sisältävien kiteiden mitogeeninen vaikutus ei johtunut ympäröivän ravintoalustan kalsiumpitoisuuden lisääntymisestä in vitro, koska emäksisten kalsiumfosfaattikiteiden liukeneminen ravintoalustaan ei stimuloinut ( ^3H )-tymidiinin liittymistä fibroblasteihin.

Yksi ehdotettu mekanismi OFC:n indusoimalle mitogeneesille on, että epänormaali nivelkalvon solujen lisääntyminen voi johtua ainakin osittain endosytoosista ja kiteiden solunsisäisestä liukenemisesta, mikä lisää sytoplasmisen Ca2 ⁺ -pitoisuuden nousua ja aktivoi kalsiumista riippuvan reitin, joka johtaa mitogeneesiin. Tätä käsitystä tukee suoran solu-kidekontaktin vaatimus mitogeneesin stimuloimiseksi, koska soluviljelmien altistuminen kiteille indusoi solujen kasvua, kun taas solujen, joilla ei ollut tällaista kontaktia, altistuminen ei. Kiteiden fagosytoosin tarpeen tutkimiseksi solu-kide-vuorovaikutuksen jälkeen soluja viljeltiin ^45Ca -OPC:n ja ( ^3H )-tymidiinin kanssa. Havaittiin, että ^45Ca -OPC:tä sisältävät solut sisällyttivät merkittävästi enemmän ( ^3H )-tymidiiniä kuin solut, joissa ei ollut emäksistä kalsiumfosfaattimerkintää. Makrofagiviljelmissä kiteiden endosytoosin esto sytokalasiinilla johti kiteiden liukenemisen estymiseen, mikä korostaa entisestään fagosytoosin tarvetta.

Kalsiumia sisältävät kiteet liukenevat happoon. Fagosytoosin jälkeen kiteet liukenevat makrofagien fagolysosomien happamassa ympäristössä. Klorokiini, ammoniumkloridi, bafilomysiini A1 ja kaikki lysosomotrofiset aineet, jotka nostavat lysosomien pH:ta, estävät annoksesta riippuvaisesti solunsisäisen kiteiden liukenemisen ja (3H)-tymidiinin oton ^{fibroblasteissa}, joita viljellään emäksisten kalsiumfosfaattikiteiden kanssa.

OFC-kiteiden lisääminen yksikerroksiseen fibroblastiviljelmään aiheutti välittömän kymmenkertaisen solunsisäisen kalsiumin lisääntymisen, joka palautui lähtötasolle 8 minuutin kuluttua. Kalsiumin lähde oli pääasiassa solunulkoinen ioni, koska emäksiset kalsiumfosfaattikiteet lisättiin kalsiumittomaan viljelyalustaan. Seuraava solunsisäisen kalsiumpitoisuuden nousu havaittiin 60 minuutin kuluttua ja kesti vähintään 3 tuntia. Tässä kalsiumin lähteenä olivat fagolysosomeihin liuenneet fagosytoidut kiteet.

OFC-kiteiden mitogeenisen vaikutuksen havaittiin olevan samanlainen kuin PDGF:n kasvutekijänä; kuten jälkimmäisellä, OFC-kiteillä on synergististä vaikutusta IGF-1:n ja veriplasman kanssa. IGF-1:n esto vähentää solujen mitogeneesiä vasteena OFC:lle. PG Mitchell ym. (1989) osoittivat, että mitogeneesin indusointi Balb/c- ₃ T3 -fibroblasteissa OFC- _kiteillä vaatii seriini/treoniiniproteiinikinaasi C:n (PKC) läsnäoloa, joka on yksi tärkeimmistä signaalien välittäjistä, joita syntyy solujen ulkoisen stimulaation aikana hormoneilla, välittäjäaineilla ja kasvutekijöillä. PKC-aktiivisuuden väheneminen Balb/c-3 T3 -soluissa _estääOFC:n välittämän proto-onkogeenien c-fos- ja c-myc-induktion, mutta ei vaikuta näiden onkogeenien PDGF:n välittämään stimulaatioon.

Fagosytoitujen kiteiden liukenemisen jälkeinen solunsisäisen kalsiumin lisääntyminen ei ole ainoa mitogeneesin signalointireitti. Kun kasvutekijät, kuten PDGF, sitoutuvat kalvoreseptoriinsa, fosfolipaasi C (fosfodiesteraasi) stimuloituu. Se hydrolysoi fosfatidyyli-inositoli-4,5-bisfosfaatin muodostaen solunsisäisiä lähettejä inositoli-3-fosfaattia ja diasyyliglyserolia. Ensimmäinen vapauttaa kalsiumia endoplasmisesta retikulumista moduloimalla kalsiumista riippuvien ja kalsium/kalmoduliinista riippuvien entsyymien, kuten proteiinikinaasien ja proteaasien, aktiivisuutta.

R. Rothenberg ja H. Cheung (1988) raportoivat fosfatidyyli-inositoli-4,5-bisfosfaatin lisääntynyttä hajoamista fosfolipaasi C:n vaikutuksesta kaniinin nivelkalvon soluissa vasteena OFC-kiteillä stimulaatioon. Jälkimmäinen lisäsi merkittävästi inositoli-1-fosfaatin pitoisuutta soluissa, joissa oli merkittyä ( ^3H )-inositoli; huippu saavutettiin minuutin kuluessa ja säilyi noin tunnin ajan.

Diasyyliglyseroli on kalsiumpyrofosfaattidihydraatin mahdollinen aktivaattori. Koska OFC-kiteet lisäävät fosfolipaasi C:n aktiivisuutta, mikä johtaa diasyyliglyserolin kertymiseen, voidaan odottaa PKC:n aktivaation lisääntymistä. PG Mitchell ym. (1989) vertasivat OFC-kiteiden ja PDGF:n vaikutuksia Balb/c- _{3T3-fibroblastien} DNA-synteesiin. Soluviljelmässä PKC inaktivoitiin inkuboimalla soluja kasvainta tukevan forbolidiesterin (TPD), diasyyliglyserolin analogin, kanssa. Pitkäaikainen stimulaatio pienillä TPD-annoksilla vähensi PKC:n aktiivisuutta, kun taas kerta-stimulaatio suurella annoksella aktivoi sen. OFC-kiteiden DNA-synteesin stimulaatio estyi PKC:n inaktivoinnin jälkeen, mikä osoittaa tämän entsyymin merkityksen OFC:n indusoimassa mitogeneesissä. Aiemmin GM McCarthy ym. (1987) osoittivat yhteyden ihmisen fibroblastien mitogeenisen vasteen OFC-kiteille ja PKC:n aktivaation välillä. OFC-kiteet eivät kuitenkaan aktivoi fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasia tai tyrosiinikinaaseja, mikä vahvistaa, että OFC-kiteiden soluaktivaatiomekanismi on selektiivinen.

Solujen lisääntymistä säätelee joukko geenejä, joita kutsutaan proto-onkogeeneiksi. Proto-onkogeenien c-fos ja c-myc tuotteita olevat foe- ja mye-proteiinit sijaitsevat solun tumassa ja sitoutuvat spesifisiin DNA-sekvensseihin. 3T3-fibroblastien stimulointi OFC-kiteillä johtaa c-fos-ekspressioon muutamassa minuutissa, ja se saavuttaa maksiminsa 30 minuuttia stimulaation jälkeen. OFC-kiteiden tai PDGF:n indusoima c-myc-transkriptio tapahtuu 1 tunnin kuluessa ja saavuttaa maksiminsa 3 tuntia stimulaation jälkeen. Solut ylläpitävät kohonnutta c-fos- ja c-myc-transkriptiotasoa vähintään 5 tuntia. Soluissa, joissa PCD on inaktivoitu, OFC- tai TFD-kiteiden aiheuttama c-fos- ja c-myc-stimulaatio vähenee merkittävästi, kun taas PDGF:n aiheuttama näiden geenien induktio ei muutu.

Mitogeeniaktivoitujen proteiinikinaasien (MAP K) perheen jäsenet ovat keskeisiä säätelijöitä useissa solunsisäisissä signalointikaskadeissa. Yksi tämän perheen alaluokka, p42/p44, säätelee solujen lisääntymistä mekanismin kautta, johon liittyy proto-onkogeenien c-fos ja c-jun aktivaatio. OFC- ja PFKD-kiteet aktivoivat proteiinikinaasisignalointireitin, johon osallistuvat sekä p42 että p44, mikä viittaa tämän reitin rooliin kalsiumia sisältävien kiteiden indusoimassa mitogeneesissä.

Lopuksi, OFC:n indusoimaan mitogeneesiin liittyy transkriptiotekijä tumatekijä κB (NF-κB), joka kuvattiin ensimmäisen kerran immunoglobuliinin κ kevytketjun (IgK) geeninä. Se on indusoituva transkriptiotekijä, jolla on tärkeä rooli monissa signalointireiteissä, koska se säätelee useiden geenien ilmentymistä. NF-κB:n induktioon liittyy yleensä inhiboivien proteiinien, IκB:n, vapautuminen sytoplasmasta. NF-κB:n induktiota seuraa aktiivisen transkriptiotekijän siirtyminen tumaan. OFC-kiteet indusoivat NF-κB:tä Balb/c- _3T3 -fibroblasteissa ja ihmisen ihon fibroblasteissa.

NF-κB:n aktivaation jälkeiseen signaalinsiirtoon voi osallistua useita reittejä, mutta kaikkiin liittyy proteiinikinaaseja, jotka fosforyloivat (ja siten hajottavat) IκB:tä. In vitro -tutkimusten perusteella IκB:n ajateltiin aiemmin toimivan kinaasien (esim. PKC:n ja proteiinikinaasi A:n) substraattina. Suurimolekyylipainoinen IκB-kinaasikompleksi on kuitenkin äskettäin tunnistettu. Nämä kinaasit fosforyloivat spesifisesti IκB:n seriinitähteitä. NF-κB:n aktivaatio TNF-α:n ja IL-1:n avulla vaatii NF-κB:tä indusoivan kinaasin (NIK) ja IκB-kinaasin tehokasta toimintaa. NIK:n aktivaation molekyylimekanismi on tällä hetkellä tuntematon. Vaikka OFC-kiteet aktivoivat sekä PKC:n että NF-κB:n, ei tiedetä, missä määrin nämä kaksi prosessia ovat yhteydessä toisiinsa. Koska GκB-kinaasin modifikaatio tapahtuu fosforylaation kautta, PKC:n roolia NF-κB:n indusoinnissa OFC-kiteillä fosforylaation ja GκB-kinaasin aktivaation kautta ei voida sulkea pois. Tätä käsitystä tukee PKC-estäjän staurosporiinin aiheuttama OFC-kiteiden indusoiman mitogeneesin ja NF-κB:n ilmentymisen esto. Samoin staurosporiini voi estää GκB-kinaasia ja siten estää proteiinikinaasi A:ta ja muita proteiinikinaaseja.

Siten OFC-kiteiden indusoiman mitogeneesin mekanismi fibroblasteissa sisältää ainakin kaksi erilaista prosessia:

• nopea kalvoon sitoutuva tapahtuma, joka johtaa PKC:n ja MAP K:n aktivoitumiseen, NF-κB:n ja proto-onkogeenien induktioon,
• ^{kiteiden hitaampi solunsisäinen liukeneminen, mikä johtaa Ca2 +:} n solunsisäisen pitoisuuden kasvuun ja sitten useiden kalsiumista riippuvien prosessien aktivoitumiseen, jotka stimuloivat mitogeneesiä.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

MMP-kalsiumia sisältävien kiteiden indusointi

Kalsiumia sisältävien kiteiden aiheuttamien kudosvaurioiden välittäjinä toimivat MMP:t - kollagenaasi-1, stromelysiini, 92 kD gelatinaasi ja kollagenaasi-3.

Koska OFC-kidepitoisuuden ja nivelkudoksen tuhoutumisen välillä oli yhteys, esitettiin hypoteesi, jonka mukaan nivelkalvon solut fagosytoivat OFC-kiteitä ja mahdollisesti joitakin kollageeneja. Stimuloidut synovosyytit lisääntyvät ja erittävät proteaaseja. Tätä hypoteesia testattiin in vitro lisäämällä luonnollisia tai synteettisiä OFC:tä, PFCD:tä ja muita kiteitä viljeltyihin ihmisen tai koiran synovosyytteihin. Neutraalien proteaasien ja kollagenaasien aktiivisuus lisääntyi annoksesta riippuvaisesti ja oli noin 5–8 kertaa suurempi kuin kontrollisoluviljelmässä, jota kasvatettiin ilman kiteitä.

Kiteitä sisältävässä elatusaineessa viljellyissä soluissa havaittiin kollagenaasi-1:n, stromelysiinin ja gelatinaasi-92 kDa mRNA:n yhteisinduktio, jota seurasi entsyymien eritys elatusaineeseen.

OFC-kiteet indusoivat myös kollagenaasi-1:n ja kollagenaasi-2:n mRNA:n kertymistä kypsiin sian kondrosyytteihin, minkä jälkeen entsyymit erittyivät kasvualustaan.

GM McCarty ym. (1998) tutkivat solunsisäisen kiteiden liukenemisen roolia kiteiden indusoimassa MMP-tuotannossa. Lysosomien pH:n nostaminen bafilomysiini A:lla esti solunsisäisen kiteiden liukenemisen ja myös heikensi ihmisen fibroblastien proliferatiivista vastetta OFC-kiteille, mutta ei estänyt MMP:n synteesiä ja eritystä.

Eivät emäksinen kalsiumfosfaatti eivätkä PFCD-kiteet indusoineet IL-1:n tuotantoa in vitro, mutta natriumuraattikiteet indusoivat.

Nykytiedot osoittavat selvästi, että fibroblastit ja kondrosyytit stimuloivat MMP-tuotantoa suoraan joutuessaan kosketuksiin kalsiumia sisältävien kiteiden kanssa.

Nivelrikon oireet viittaavat MMP:n merkittävään rooliin taudin etenemisessä. Kalsiumia sisältävien kiteiden läsnäolo lisää sairastuneiden nivelten kudosten rappeutumista.

Prostaglandiinisynteesin stimulaatio

Solujen kasvun ja entsyymien erityksen stimuloinnin ohella kalsiumia sisältävät kiteet aiheuttavat prostaglandiinien, erityisesti PGE2:n, vapautumista nisäkässoluviljelmistä _. PGE2:n vapautuminen tapahtuu _kaikissa tapauksissa ensimmäisen tunnin kuluessa solujen altistumisesta kiteille. R. Rothenberg (1987) totesi, että arakidonihapon tärkeimmät lähteet PGE2:n synteesissä _ovat fosfatidyylikoliini ja fosfatidyylietanoliamiini, ja vahvisti myös, että fosfolipaasi A2 _{ja NOX ovat PGE2:ntuotannon} hallitsevat reitit.

PGE1:tä voi myös vapautua vasteena OFA-kiteille. GM McCarty ym. (1993, 1994) tutkivat PGE2:n _, PGE:n ja sen analogin misoprostolin vaikutuksia ihmisen fibroblastien mitogeeniseen vasteeseen OFA-kiteille. Kaikki kolme ainetta estivät mitogeenisen vasteen annoksesta riippuvalla tavalla, PGE:n ja misoprostolin osoittaessa voimakkaampaa estävää aktiivisuutta. PGE2 ja misoprostoli, mutta eivät PGE2 _, estivät kollagenaasi-mRNA:n kertymistä vasteena OFA-kiteille.

MG McCarty ja H. Cheung (1994) tutkivat OFC:n välittämän solujen aktivaatiomekanismia PGE:llä. Kirjoittajat osoittivat, että PGE, joka on voimakkaampi solunsisäisen cAMP:n indusoija kuin PGE2 _, ja PGE, estävät OFC:n indusoimaa mitogeneesiä ja MMP-tuotantoa cAMP-riippuvaisen signaalitransduktioreitin kautta. On mahdollista, että OFC-kiteiden indusoima PGE-tuotannon lisääntyminen heikentää niiden muita biologisia vaikutuksia (mitogeneesiä ja MMP-tuotantoa) takaisinkytkentämekanismin kautta.

Kristallin aiheuttama tulehdus

Kalsiumia sisältäviä kiteitä esiintyy usein nivelrikkopotilaiden nivelnesteessä, mutta akuutit tulehdukset leukosytoosin kera ovat harvinaisia sekä nivelrikossa että kiteisiin liittyvissä nivelsairauksissa (esimerkiksi Milwaukeen olkapääoireyhtymässä). Kiteiden flogistista potentiaalia voivat muuttaa useat estävät tekijät. R. Terkeltaub ym. (1988) osoittivat veriseerumin ja plasman kyvyn estää merkittävästi neutrofiilisten granulosyyttien vastetta emäksisille kalsiumfosfaattikiteille. Tällaisen eston aiheuttavat tekijät ovat kiteitä sitovat proteiinit. Yhden näistä proteiineista, ₂ -HS-glykoproteiinin (AHSr), tutkimus osoitti, että AHSР on tehokkain ja spesifisin neutrofiilisten granulosyyttien vasteen OFC-kiteille estäjä. AHSr on maksaperäinen seerumiproteiini; Tiedetään, että verrattuna muihin seerumiproteiineihin sitä esiintyy suhteellisen suurina pitoisuuksina luussa ja mineralisoituvassa kudoksessa. Lisäksi AHSr:ää esiintyy "ei-tulehduneessa" nivelnesteessä ja sitä on havaittu myös emäksisillä kalsiumfosfaattikiteillä natiivissa nivelnesteessä. Näin ollen ei voida sulkea pois mahdollisuutta, että AHSr moduloi emäksisten kalsiumfosfaattikiteiden flogogeenistä potentiaalia in vivo.

Yhteenvetona kaikista yllä olevista esittelemme kaksi nivelrikon patogeneesikaaviota, joita ovat ehdottaneet WB van den Berg et ai. (1999) ja M. Carrabba et ai. (1996), joissa yhdistyvät mekaaniset, geneettiset ja biokemialliset tekijät.