Entsyymien ja sytokiinien rooli nivelrikon patogeneesissä

Viime vuosina tutkijat ovat kiinnittäneet paljon huomiota nivelruston solukalvon (ECM) hajoamisesta vastaavien proteaasien tunnistamiseen nivelrikossa. Nykykäsitysten mukaan matriksin metalloproteinaaseilla (MMP) on tärkeä rooli nivelrikon patogeneesissä. Nivelrikon sairastavilla potilailla havaitaan kolmen MMP:n (kollagenaasien, stromelysiinien ja gelatinaasien) lisääntynyt taso. Kollagenaasi vastaa natiivin kollageenin hajoamisesta, stromelysiini tyypin IV kollageenin, proteoglykaanien ja laminiinin hajoamisesta, gelatinaasi gelatiinin, kollageenien IV, Vh XI tyyppien ja elastiinin hajoamisesta. Lisäksi oletetaan toisen entsyymin, aggrekanaasin, läsnäoloa, jolla on MMP:iden ominaisuudet ja joka vastaa rustoproteoglykaanien aggregaattien proteolyysistä.

Ihmisen nivelrustosta on tunnistettu kolmenlaisia kollagenaaseja, joiden pitoisuudet ovat merkittävästi koholla nivelrikkopotilailla : kollagenaasi-1 (MMP-1), kollagenaasi-2 (MMP-8) ja kollagenaasi-3 (MMP-13). Kolmen erityyppisen kollagenaasin samanaikainen esiintyminen nivelrustossa viittaa siihen, että jokaisella niistä on oma erityinen roolinsa. Kollagenaasit-1 ja -2 sijaitsevat pääasiassa nivelruston pinnallisessa ja ylemmässä välivyöhykkeessä, kun taas kollagenaasi-3:a löytyy alemmasta välivyöhykkeestä ja syvästä vyöhykkeestä. Lisäksi immunohistokemiallisen tutkimuksen tulokset osoittivat, että nivelrikon edetessä kollagenaasi-3:n taso saavuttaa tasaantumisen ja jopa laskee, kun taas kollagenaasi-1:n taso vähitellen nousee. On näyttöä siitä, että nivelrikossa kollagenaasi-1 osallistuu pääasiassa nivelruston tulehdusprosessiin, kun taas kollagenaasi-3 osallistuu kudosten uudelleenmuodostukseen. Nivelrikon potilaiden rustossa ilmentyvä kollagenaasi-3 hajottaa tyypin II kollageenia intensiivisemmin kuin kollagenaasi-1.

Toisen metalloproteinaasiryhmän edustajista kolme on tunnistettu myös ihmisen stromelysiinistä: stromelysiini-1 (MMP-3), stromelysiini-2 (MMP-10) ja stromelysiini-3 (MMP-11). Nykyään tiedetään, että vain stromelysiini-1 on osallisena nivelrikon patologisessa prosessissa. Stromelysiini-2:ta ei havaita nivelrikosta kärsivien potilaiden nivelkalvossa, mutta sitä löytyy hyvin pieninä määrinä nivelreumapotilaiden nivelkalvon fibroblasteista. Myös stromelysiini-3:a löytyy nivelreumapotilaiden nivelkalvosta fibroblastien läheltä, erityisesti fibroosivyöhykkeiltä.

Ihmisen rustokudoksen gelatinaasiryhmästä on tunnistettu vain kaksi: 92 kD gelatinaasi (gelatinaasi B eli MMP-9) ja 72 kD gelatinaasi (gelatinaasi A eli MMP-2); nivelrikkopotilailla havaitaan 92 kD gelatinaasin tason nousua.

Äskettäin on tunnistettu toinen ryhmä MMP-entsyymejä, jotka sijaitsevat solukalvojen pinnalla ja joita kutsutaan kalvotyyppisiksi MMP-entsyymeiksi (MMP-MT). Tähän ryhmään kuuluu neljä entsyymiä - MMP-MT1 - MMP-MT-4. MMP-MT:n ilmentymistä on löydetty ihmisen nivelrustosta. Vaikka MMP-MT-1:llä on kollagenaasiominaisuuksia, sekä MMP-MT-1 että MMP-MT-2 -entsyymit kykenevät aktivoimaan gelatinaasi-72 kDa:n ja kollagenaasi-3:n. Tämän MMP-entsyymiryhmän rooli nivelrikon patogeneesissä vaatii selvennystä.

Proteinaasit erittyvät tsymogeenin muodossa, jota aktivoivat muut proteinaasit tai orgaaniset elohopeayhdisteet. MMP:iden katalyyttinen aktiivisuus riippuu sinkin läsnäolosta entsyymin aktiivisessa vyöhykkeessä.

MMP-proteiinien biologista aktiivisuutta säätelevät spesifiset TIMP-proteiinit. Tähän mennessä on tunnistettu kolmenlaisia TIMP-proteiineja, joita löytyy ihmisen nivelkudoksista: TIMP-1–TIMP-3. Neljäs TIMP-tyyppi on tunnistettu ja kloonattu, mutta sitä ei ole vielä havaittu ihmisen nivelkudoksista. Nämä molekyylit sitoutuvat spesifisesti MMP-proteiinien aktiiviseen kohtaan, vaikka jotkut niistä pystyvät sitoutumaan 72 kD:n progelatinaasin (TIMP-2, -3, -4) ja 92 kD:n progelatinaasin (TIMP-1 ja -3) aktiiviseen kohtaan. Todisteet viittaavat siihen, että nivelrikossa MMP- ja TIMP-proteiinien välillä on epätasapaino nivelrustossa, mikä johtaa inhibiittorien suhteelliseen puutteeseen, mikä saattaa johtua osittain aktiivisten MMP-proteiinien pitoisuuden noususta kudoksessa. TIMP-1 ja -2 löytyvät nivelrustosta, ja kondrosyytit syntetisoivat niitä. Nivelrikossa vain tyypin I TIMP:tä havaitaan nivelkalvossa ja nivelnesteessä. TIMP-3:a löytyy yksinomaan solunulkokalvosta (ECM). TIMP-4:n aminohapposekvenssistä lähes 50 % on sama TIMP-2:n ja 38 % TIMP-1:n kanssa. Muissa kohdesoluissa TIMP-4 vastaa 72 kD:n progelatinaasin aktivaation säätelystä solun pinnalla, mikä osoittaa sen tärkeän roolin kudoskohtaisena solunsisäisen massan (ECM) uudelleenmuodostumisen säätelijänä.

Toinen mekanismi MMP-proteiinien biologisen aktiivisuuden säätelyyn on niiden fysiologinen aktivaatio. Seriini- ja kysteiiniproteaasiperheen entsyymien, kuten AP/plasmiinin ja katepsiini B:n, uskotaan olevan MMP-proteiinien fysiologisia aktivaattoreita. Nivelrikkopotilaiden nivelrustossa on havaittu kohonneita urokinaasi- (uAP) ja plasmiinipitoisuuksia.

Vaikka nivelkudoksissa esiintyy useita erityyppisiä katepsiinejä, katepsiini-B:tä pidetään todennäköisimpänä MMP-proteiinien aktivaattorina rustossa. Seriini- ja kysteiiniproteaasien fysiologisia estäjiä on löydetty ihmisen nivelkudoksista. AP-1-estäjän (IAI-1) sekä kysteiiniproteaasien aktiivisuus on heikentynyt nivelrikkopotilailla. Samoin kuin MMP/TIMP:n tapauksessa, seriini- ja kysteiiniproteaasien sekä niiden estäjien välinen epätasapaino voi selittää MMP-proteiinien lisääntyneen aktiivisuuden nivelrikkopotilaiden nivelrustossa. Lisäksi MMP-proteiinit pystyvät aktivoimaan toisiaan. Esimerkiksi stromelysiini-1 aktivoi kollagenaasi-1:n, kollagenaasi-3:n ja 92 kD:n gelatinaasin; kollagenaasi-3 aktivoi 92 kD:n gelatinaasin; MMP-MT aktivoi kollagenaasi-3:n, ja gelatinaasi-72 kDa tehostaa tätä aktivaatiota; MMP-MT aktivoi myös gelatinaasi-72 kDa:n. Sytokiinit voidaan jakaa kolmeen ryhmään: tuhoisat (tulehdukselliset), säätelevät (mukaan lukien tulehdusta estävät) ja anaboliset (kasvutekijät).

Sytokiinityypit (van den Berg WB et al:n mukaan)

Tuhoisa	Interleukiini-1 TNF-α Leukemiaa estävä tekijä Interleukiini-17
Sääntely	Interleukiini-4 Interleukiini-10 Interleukiini-13 Entsyymi-inhibiittorit
Anaboliset	Munsuliinin kaltaiset kasvutekijät TGF-b Luun morfogeneettiset proteiinit Rustosta peräisin olevat morfogeneettiset proteiinit

Tuhoavat sytokiinit, erityisesti IL-1, lisäävät proteaasien vapautumista ja estävät kondrosyyttien proteoglykaanien ja kollageenien synteesiä. Säätelevät sytokiinit, erityisesti IL-4 ja IL-10, estävät IL-1:n tuotantoa, lisäävät IL-1-reseptoriantagonistin (IL-1RA) tuotantoa ja vähentävät NO-syntaasin määrää kondrosyyteissä. Näin ollen IL-4 vastustaa IL-1:tä kolmeen suuntaan: 1) vähentää tuotantoa estäen sen vaikutukset, 2) lisää tärkeimmän "siepparin" IL-1RA:n tuotantoa ja 3) vähentää tärkeimmän sekundaarisen "lähetin" NO:n tuotantoa. Lisäksi IL-4 vähentää kudoksen entsymaattista hajoamista. In vivo optimaalinen terapeuttinen vaikutus saavutetaan IL-4:n ja IL-10:n yhdistelmällä. Anaboliset tekijät, kuten TGF-β ja IGF-1, eivät itse asiassa häiritse IL-1:n tuotantoa tai vaikutusta, vaan niillä on päinvastainen vaikutus, esimerkiksi stimuloimalla proteoglykaanien ja kollageenin synteesiä, tukahduttaen proteaasien aktiivisuutta, ja TGF-β estää myös entsyymien vapautumista ja stimuloi niiden inhibiittoreita.

Tulehdusta edistävät sytokiinit vastaavat MMP-entsyymien lisääntyneestä synteesistä ja ilmentymisestä nivelkudoksissa. Ne syntetisoidaan nivelkalvossa ja diffundoituvat sitten nivelrustoon nivelnesteen kautta. Tulehdusta edistävät sytokiinit aktivoivat kondrosyyttejä, jotka puolestaan pystyvät myös tuottamaan tulehdusta edistäviä sytokiineja. Nivelrikon vaurioituneissa nivelissä tulehduksen efektorin roolia näyttelevät pääasiassa nivelkalvon solut. Makrofagityyppiset synovosyytit erittävät proteaaseja ja tulehdusvälittäjäaineita. Näistä IL-f, TNF-a, IL-6, leukemian estotekijä (LIF) ja IL-17 ovat eniten "osallistuneita" nivelrikon patogeneesiin.

Biologisesti aktiiviset aineet, jotka stimuloivat nivelruston hajoamista nivelrikossa

• Interleukiini-1
• Interleukiini-3
• Interleukiini-4
• TNF-α
• Pesäkkeitä stimuloivat tekijät: makrofagit (monosyytit) ja granulosyytti-makrofagit
• Aine P
• Sivu ₂
• Plasminogeeniaktivaattorit (kudos- ja urokinaasityypit) ja plasmiini
• Metalloproteaasit (kollagenaasit, ellastaasit, stromelysiinit)
• Katepsiinit A ja B
• Trilsin
• Bakteerien lipopolysakkaridit
• Fosfolipaasi Ag

Kirjallisuustiedot osoittavat, että IL-1 ja mahdollisesti TNF-α ovat nivelkudosvaurion tärkeimmät välittäjäaineet nivelrikossa. On kuitenkin vielä tuntematonta, toimivatko ne toisistaan riippumatta vai onko niiden välillä toiminnallinen hierarkia. Nivelrikon eläinmallit ovat osoittaneet, että IL-1:n esto estää tehokkaasti nivelruston tuhoutumista, kun taas TNF-α:n esto johtaa vain tulehduksen vähenemiseen nivelkudoksissa. Molempien sytokiinien pitoisuuksien nousua on havaittu potilaiden nivelkalvossa, nivelnesteessä ja rustossa. Rustosoluissa ne pystyvät lisäämään paitsi proteaasien (pääasiassa MMP ja AP) myös pienempien kollageenien, kuten tyypin I ja III, synteesiä ja vähentämään tyypin II ja IX kollageenien sekä proteoglykaanien synteesiä. Nämä sytokiinit stimuloivat myös reaktiivisia happilajeja ja tulehdusvälittäjiä, kuten PGE2 _:ta. Tällaisten nivelruston makromolekyylisten muutosten seurauksena nivelrikossa on korjausprosessien tehottomuus, mikä johtaa ruston hajoamiseen edelleen.

Edellä mainitut tulehdusta edistävät sytokiinit moduloivat MMP:n suppressio-/aktivaatioprosesseja nivelrikossa. Esimerkiksi TIMP-1- ja MMP-tasojen välinen epätasapaino rustossa nivelrikossa voi johtua IL-1:stä, koska in vitro -tutkimus osoitti, että IL-1 beeta -pitoisuuksien nousu johtaa TIMP-1-pitoisuuksien laskuun ja MMP-synteesin lisääntymiseen kondrosyyteissä. Myös AP-synteesiä moduloi IL-1 beeta. Nivelruston kondrosyyttien stimulointi IL-1:llä in vitro aiheuttaa annoksesta riippuvan AP-synteesin lisääntymisen ja iAP-1-synteesin jyrkän laskun. IL-1:n kyky vähentää iAP-1-synteesiä ja stimuloida AP-synteesiä on tehokas mekanismi plasmiinin muodostumiselle ja MMP:n aktivoitumiselle. Lisäksi plasmiini ei ole ainoastaan entsyymi, joka aktivoi muita entsyymejä, vaan se osallistuu myös ruston hajoamisprosessiin suoran proteolyysin kautta.

IL-ip syntetisoidaan inaktiivisena esiasteena, jonka massa on 31 kD (pre-IL-ip), ja sitten signaalipeptidin pilkkomisen jälkeen se muuttuu aktiiviseksi sytokiiniksi, jonka massa on 17,5 kD. Nivelkudoksissa, mukaan lukien nivelkalvo, nivelneste ja nivelrusto, IL-ip:tä esiintyy aktiivisessa muodossa, ja in vivo -tutkimukset ovat osoittaneet nivelkalvon kyvyn erittää tätä sytokiinia nivelrikossa. Jotkut seriiniproteaasit pystyvät muuntamaan pre-IL-ipin bioaktiiviseen muotoonsa. Nisäkkäillä tällaisia ominaisuuksia on havaittu vain yhdessä proteaasissa, joka kuuluu kysteiiniaspartaattispesifisten entsyymien perheeseen ja jota kutsutaan IL-1β:ta konvertoivaksi entsyymiksi (ICF tai kaspaasi-1). Tämä entsyymi pystyy muuntamaan pre-IL-ipin spesifisesti biologisesti aktiiviseksi "kypsäksi" IL-ip:ksi, jonka massa on 17,5 kD. ICF on 45 kD:n proentsyymi (p45), joka sijaitsee solukalvossa. p45-proentsyymin proteolyyttisen pilkkoutumisen jälkeen muodostuu kaksi alayksikköä, jotka tunnetaan nimellä p10 ja p20, joille on ominaista entsymaattinen aktiivisuus.

TNF-a syntetisoidaan myös kalvoon sitoutuneena esiasteena, jonka massa on 26 kDa; proteolyyttisellä pilkkomisella se vapautuu solusta aktiivisena liukoisena muotona, jonka massa on 17 kDa. Proteolyyttisen pilkkomisen suorittaa TNF-α:ta konvertoiva entsyymi (TNF-AC), joka kuuluu adamalitsiinien perheeseen. AR Amin ym. (1997) havaitsivat TNF-AC mRNA:n ilmentymisen lisääntymistä nivelrikkopotilaiden nivelrustossa.

IL-1 ja TNF-a välittävät kondrosyyttien ja synovosyyttien biologista aktivaatiota sitoutumalla spesifisiin reseptoreihin solun pinnalla - IL-R:ään ja TNF-R:ään. Kummallekin sytokiinille on tunnistettu kaksi reseptorityyppiä - IL-IP tyypit I ja II sekä TNF-R tyypit I (p55) ja II (p75). IL-1PI ja p55 vastaavat signaalinvälityksestä nivelkudoksen soluissa. IL-1R tyypillä I on hieman suurempi affiniteetti IL-1beetalle kuin IL-1a:lle; IL-1R tyypillä II on sitä vastoin suurempi affiniteetti IL-1a:lle kuin IL-ip:lle. On edelleen epäselvää, voiko IL-IP tyyppi II välittää IL-1-signaaleja vai toimiiko se vain IL-1:n ja IL-1R tyypin I välisen sitoutumisen kilpailevana estäjänä. Nivelrikkopotilaiden kondroidit ja nivelkalvofibroblastit sisältävät suuria määriä IL-1PI:tä ja p55:tä, mikä puolestaan selittää näiden solujen suuren herkkyyden vastaavien sytokiinien stimulaatiolle. Tämä prosessi johtaa sekä proteolyyttisten entsyymien erityksen lisääntymiseen että nivelruston tuhoutumiseen.

IL-6:n osallisuutta nivelrikon patologisessa prosessissa ei voida sulkea pois. Tämä oletus perustuu seuraaviin havaintoihin:

• IL-6 lisää tulehdussolujen määrää nivelkalvossa,
• IL-6 stimuloi kondrosyyttien lisääntymistä,
• IL-6 tehostaa IL-1:n vaikutuksia MMP-synteesin lisäämisessä ja proteoglykaanien synteesin estämisessä.

IL-6 kykenee kuitenkin indusoimaan TIMP-proteiinien tuotantoa, mutta ei vaikuta MMP-proteiinien tuotantoon, joten uskotaan, että tämä sytokiini osallistuu nivelruston proteolyyttisen hajoamisen estämiseen takaisinkytkentämekanismin avulla.

Toinen IL-6-perheen jäsen on LIF, sytokiini, jota tuottavat nivelrikkopotilailta saadut kondrosyytit vasteena tulehdusta edistävien sytokiinien IL-1p:n ja TNF-α:n stimulaatioon. LIF stimuloi ruston proteoglykaanien imeytymistä sekä MMP-synteesiä ja NO-tuotantoa. Tämän sytokiinin roolia nivelrikkossa ei ole täysin selvitetty.

IL-17 on 20–30 kD:n homodimeeri, jolla on IL-1:n kaltainen, mutta paljon vähemmän voimakas vaikutus. IL-17 stimuloi useiden tulehdusta edistävien sytokiinien, kuten IL-1p:n, TNF-a:n, IL-6:n ja MMP:n, synteesiä ja vapautumista kohdesoluissa, kuten ihmisen makrofageissa. Lisäksi IL-17 stimuloi NO-tuotantoa kondrosyyteissä. Kuten LIF:n, myös IL-17:n roolia nivelrikon patogeneesissä on tutkittu huonosti.

Epäorgaaninen vapaa radikaali NO on tärkeässä roolissa nivelruston hajoamisessa nivelrikossa. Nivelrikkopotilaista eristetyt rustosolut tuottavat suurempia määriä NO:ta sekä spontaanisti että tulehdusta edistävien sytokiinien stimulaation jälkeen verrattuna normaaleihin soluihin. Nivelrikkopotilaiden nivelnesteessä ja seerumissa on havaittu korkea NO-pitoisuus – tämä on seurausta indusoidun NO-syntaasin (hNOC) lisääntyneestä ilmentymisestä ja synteesistä. HNOC on entsyymi, joka vastaa NO:n tuotannosta. Äskettäin kondrosyyttispesifisen hNOC:n DNA kloonattiin ja entsyymin aminohapposekvenssi määritettiin. Aminohapposekvenssi osoittaa 50 %:n identtisyyttä ja 70 %:n samankaltaisuutta endoteelille ja hermokudokselle spesifisen hNOC:n kanssa.

NO estää nivelruston solukalvon makromolekyylien synteesiä ja stimuloi MMP:n synteesiä. Lisäksi NO-tuotannon lisääntymiseen liittyy IL-IP-antagonistin (IL-1RA) synteesin väheneminen kondrosyyteissä. Näin ollen IL-1-pitoisuuden nousu ja IL-1RA-pitoisuuden lasku johtavat NO:n hyperstimulaatioon kondrosyyteissä, mikä puolestaan johtaa rustomatriisin lisääntyneeseen hajoamiseen. On raportteja selektiivisen hNOC-estäjän terapeuttisesta vaikutuksesta in vivo kokeellisen nivelrikon etenemiseen.

Luonnolliset sytokiinien estäjät pystyvät estämään suoraan sytokiineja sitoutumasta solukalvon reseptoreihin, mikä vähentää niiden tulehdusta edistävää aktiivisuutta. Luonnolliset sytokiinien estäjät voidaan jakaa kolmeen luokkaan vaikutusmekanisminsa perusteella.

Ensimmäiseen inhibiittoriluokkaan kuuluvat reseptoriantagonistit, jotka estävät ligandin sitoutumisen reseptoriinsa kilpailemalla sitoutumiskohdasta. Tähän mennessä tällainen inhibiittori on löydetty vain IL-1:lle – tämä on edellä mainittu IL-1/ILIP-järjestelmän kilpaileva inhibiittori IL-1 PA. IL-1 PA estää monia nivelkudoksissa havaittuja vaikutuksia, mukaan lukien prostaglandiinien synteesi nivelkalvon soluissa, kollagenaasin tuotanto kondrosyyteissä ja nivelruston luukudoksen hajoaminen.

IL-1RA:ta esiintyy eri muodoissa – yhtenä liukoisena (rIL-1RA) ja kahtena solujen välisenä (μIL-lPAI ja μIL-1RAP). Liukoisen IL-1RA:n muodon affiniteetti on viisi kertaa suurempi kuin solujen välisten muotojen. Intensiivisestä tieteellisestä tutkimuksesta huolimatta jälkimmäisten toiminta on edelleen tuntematon. In vitro -kokeet ovat osoittaneet, että IL-1beta-aktiivisuuden estäminen vaatii 10–100 kertaa normaalia suurempaa IL-1RA-pitoisuutta, kun taas in vivo -olosuhteet vaativat tuhatkertaisen IL-1RA-pitoisuuden kasvun. Tämä seikka voi osittain selittää IL-1RA:n suhteellisen puutteen ja IL-1:n liikamäärän nivelkalvossa nivelrikosta kärsivillä potilailla.

Toinen luonnollisten sytokiinien estäjien luokka ovat liukoiset sytokiinireseptorit. Esimerkkejä tällaisista ihmisillä esiintyvistä nivelrikon patogeneesiin liittyvistä estäjistä ovat rIL-1R ja pp55. Liukoiset sytokiinireseptorit ovat normaalien reseptorien lyhentyneitä muotoja; sitoutuessaan sytokiineihin ne estävät niiden sitoutumisen kohdesolujen kalvoon liittyviin reseptoreihin kilpailevan antagonismin mekanismin kautta.

Liukoisten reseptorien tärkein esiaste on kalvoon sitoutunut IL-1RP. rIL-IP:n affiniteetti IL-1:een ja IL-1RA:han on erilainen. Siten rIL-1RN:llä on suurempi affiniteetti IL-1β:aan kuin IL-1RA:han, ja rIL-1PI:llä on suurempi affiniteetti IL-1RA:han kuin IL-ip:hen.

TNF:lle on myös kahdenlaisia liukoisia reseptoreita - pp55 ja pp75. Kuten liukoiset IL-1-reseptorit, ne muodostuvat "irtoamalla". Molempia reseptoreita löytyy in vivo -olosuhteissa sairastuneiden nivelten kudoksista. Liukoisten TNF-reseptorien roolista nivelrikon patogeneesissä keskustellaan. Oletetaan, että pieninä pitoisuuksina ne stabiloivat TNF:n kolmiulotteista rakennetta ja pidentävät bioaktiivisen sytokiinin puoliintumisaikaa, kun taas suuret pp55- ja pp75-pitoisuudet voivat vähentää TNF:n aktiivisuutta kilpailevan antagonismin kautta. Todennäköisesti pp75 voi toimia TNF:n kantajana, mikä helpottaa sen sitoutumista kalvoon sitoutuneeseen reseptoriin.

Luonnollisten sytokiinien estäjien kolmatta luokkaa edustaa tulehdusta estävien sytokiinien ryhmä, johon kuuluvat TGF-beeta, IL-4, IL-10 ja IL-13. Tulehdusta estävät sytokiinit vähentävät tulehdusta edistävien ja joidenkin proteaasien tuotantoa ja stimuloivat IL-1RA:n ja TIMP:n tuotantoa.