Tuberkuloosin laboratoriodiagnoosi

Tuberkuloosi on sairaus, joka on helppo diagnosoida nykyaikaisissa olosuhteissa ja tieteellisten saavutusten ansiosta. Tuberkuloosin laboratoriodiagnostiikka on keskeisessä asemassa muiden diagnostisten menetelmien joukossa, toiseksi vain röntgentutkimusmenetelmien jälkeen.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Kliininen verikoe

Tuberkuloosipotilailla yleisen verikokeen muutokset eivät ole patognomonisia. Rajallisissa ja matala-aktiivisissa tuberkuloosimuodoissa on tyypillistä normaalin määrän punasolujen hypokromia. Massiivisissa infiltraateissa tai tapauskeuhkokuumeessa, laajalle levinneessä tapauslymfadeniitissa, spesifisissä suolistovaurioissa sekä suurissa keuhko- tai leikkauksen jälkeisissä verenvuodoissa havaitaan erytropeniaa ja mikrosytoosia, oligokromasiaa ja polykromasiaa. Makrosytoosia ja erityisesti poikilosytoosia esiintyy paljon harvemmin, yleensä vaikean anemian yhteydessä. Retikulosyyttien määrä tuberkuloosin kompensoidussa vaiheessa vaihtelee 0,1–0,6 %:n välillä, subkompensoidussa vaiheessa 0,6–1,0 %:n välillä ja dekompensoidussa vaiheessa 1 % retikulosyyttejä on tyypillistä.

Joissakin tuberkuloositapauksissa voidaan havaita kohtalaista leukosytoosia (jopa 15 tuhatta leukosyyttiä), harvemmin leukopeniaa, jota esiintyy 2–7 %:ssa tapauksista potilailla, joilla on rajoitettu ja lievä prosessimuoto, ja 12,5 %:ssa tuhoisassa ja etenevässä keuhkotuberkuloosissa.

Useimmiten muutoksia esiintyy leukosyyttikaavassa. Sekä suhteellista että absoluuttista neutrofiliaa havaitaan, leukosyyttikaavassa on kohtalainen siirtymä vasemmalle promyelosyyttejä kohti. Myelosyyttejä esiintyy hyvin harvoin komplisoitumattomassa tuberkuloosissa. Patologisen rakeisuuden omaavien neutrofiilien määrän lisääntyminen tuberkuloosipotilaan hemogrammissa osoittaa aina prosessin kestoa: vaikeaa tuberkuloosia sairastavilla potilailla lähes kaikki neutrofiilit ovat patologisen rakeisia. Kun tuberkuloosiepidemia laantuu, ydinsiirtymä palautuu normaaliksi suhteellisen nopeasti. Neutrofiilien patologinen rakeisuus kestää yleensä pidempään kuin muut muutokset hemogrammissa.

Eosinofiilien pitoisuus ääreisveressä vaihtelee myös prosessin vaiheen ja organismin allergisen tilan mukaan. Niiden määrä vähenee aneosinofiliaan asti taudin vakavissa ja pitkittyneissä puhkeamisissa ja päinvastoin kasvaa infiltraattien ja pleuraeffuusion imeytymisen aikana sekä primaarisen tuberkuloosin varhaisissa muodoissa.

Useimpiin primaarisen tuberkuloosin muotoihin liittyy lymfopeniaa, jota joskus havaitaan useita vuosia jopa tiettyjen muutosten arpeutumisen jälkeen. Akuutissa vaiheessa olevaan sekundaariseen tuberkuloosiin voi prosessin vakavuudesta riippuen liittyä joko normaali lymfosyyttien määrä tai lymfopenia.

Tuberkuloosiprosessin arviointiin käytettävien testien joukossa erityinen paikka on punasolujen sedimentaationopeuden (ESR) määrittämisellä, jolla on tärkeä rooli tuberkuloosiprosessin kulun arvioinnissa ja sen aktiivisten muotojen tunnistamisessa. ESR:n nousu osoittaa patologisen prosessin (tarttuva ja tulehduksellinen, märkivä, septinen, hemoblastoosi, lymfogranulomatoosi jne.) läsnäoloa ja toimii indikaattorina sen vakavuudesta, mutta normaalit ESR-arvot eivät aina osoita patologian puuttumista. Punasolujen sedimentaation kiihtymistä edistävät globuliinien, fibrinogeenin ja kolesterolin pitoisuuden nousu veressä sekä veren viskositeetin lasku. Punasolujen sedimentaation hidastuminen on ominaista tiloille, joihin liittyy hemokonsentraatiota, albumiinien ja sappihappojen pitoisuuden nousua.

Tuberkuloosipotilaiden hemogrammi muuttuu hoidon aikana. Mitä onnistuneempi hoito on, sitä nopeammin hematologiset muutokset häviävät. Samalla on pidettävä mielessä erilaisten bakteerilääkkeiden vaikutus hematopoieesiin. Ne aiheuttavat usein eosinofiliaa, joissakin tapauksissa leukosytoosia ja useammin leukopeniaa, aina agranulosytoosiin ja lymfoidis-retikulaariseen reaktioon asti. Systemaattinen hematologinen seuranta ja saatujen tietojen oikea analysointi ovat välttämättömiä potilaan kliinisen tilan, prosessin dynamiikan ja hoidon tehokkuuden arvioimiseksi.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Kliininen virtsaanalyysi

Virtsatietuberkuloosissa virtsaanalyysi on tärkein laboratoriodiagnostiikkamenetelmä. Virtsanäytteessä voi esiintyä leukosyturiaa, erytrosyturiaa, proteinuriaa, hypoisostenuriaa, tuberkuloottista mykobakteeriuriaa ja epäspesifistä bakteriuriaa.

Leukosyturia on yleisin virtsateiden tuberkuloosin oire ennen spesifistä kemoterapiaa, ja sitä esiintyy vain poikkeustapauksissa, kuten virtsanjohtimen täydellisessä tukkeutumisessa. Nechiporenkon testi (leukosyyttien määrän määritys 1 ml:ssa virtsaa) auttaa arvioimaan objektiivisemmin leukosyturian astetta nefrotuberkuloosissa ja joissakin tapauksissa havaitsemaan sen normaalilla yleisvirtsa-analyysillä. On kuitenkin otettava huomioon, että leukosyturiaa voi esiintyä akuutissa ja kroonisessa pyelonefriitissä, kystiitissä, virtsaputkentulehduksessa, munuaiskivien ja virtsanjohtimien yhteydessä.

Punasolutuberkuloosi, kuten leukosyturiakin, on yksi yleisimmistä urogenitaalisen tuberkuloosin laboratoriolöydöksistä. Hematurian esiintyvyys riippuu prosessin esiintyvyydestä; se lisääntyy munuaisten tuhoisan tuberkuloosiprosessin kehittyessä. Punasolutuberkuloosi ilman leukosyturiaa on tyypillisempää munuaistuberkuloosin varhaisvaiheissa. Hematuria, joka on vallitsevampi kuin leukosyturia, on tärkeä argumentti munuaistuberkuloosin puolesta erotettaessa sitä epäspesifisestä pyelonefriitistä.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Biokemiallinen verikoe

Tuberkuloosissa joidenkin biokemiallisten indikaattoreiden muutokset riippuvat ensisijaisesti prosessin vaiheesta, komplikaatioista ja erilaisista samanaikaisista sairauksista. Potilailla, joilla on inaktiivinen keuhkojen ja muiden elinten tuberkuloosi, veriseerumin kokonaisproteiini ja proteiinifraktiot eivät muutu ja määräävät niiden normaalin pitoisuuden.

Taudin akuuteissa muodoissa sekä kroonisten tuberkuloosimuotojen pahenemisessa ja etenemisessä albumiini-globuliinikerroin pienenee.

Merkittävän tärkeä osa tuberkuloosin ja sen komplikaatioiden maksan toiminnallisen tilan ja orgaanisen vaurion arviointia on suoran ja kokonaisbilirubiinin, aspartaattiaminotransferaasin (AST) ja alaniiniaminotransferaasin (ALT) määrittäminen veriseerumista. Aminotransferaasien tason dynaaminen määritys. Bilirubiinin pitoisuus tuberkuloosipotilaiden hoidossa, erityisesti sen vaikeissa muodoissa, on pakollinen osa tuberkuloosipotilaiden biokemiallista tutkimusta ja se suoritetaan kuukausittain.

Munuaisten toiminnallisen tilan arviointiin kuuluu seerumin kreatiniinin määritys ja glomerulaarisen suodatusnopeuden laskeminen Cockcroft-Gaultin kaavaa käyttäen. Glomerulaarisen suodatusnopeuden laskeminen Rebergin testillä antaa vähemmän tarkkoja tuloksia.

Tuberkuloosipotilaiden dynaamisten biokemiallisten tutkimusten päätavoitteena on seurata prosessin kulkua, lääkkeiden sivuvaikutusten oikea-aikainen havaitseminen ja uusien homeostaasihäiriöiden riittävä korjaaminen.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Biokemiallisten tutkimusmenetelmien soveltaminen keuhkojen ulkopuolisessa tuberkuloosissa

Informatiivisimmaksi indikaattoriksi pidetään tuberkulosteariinihapon pitoisuutta biologisissa nesteissä, mutta sen määrittämiseen liittyy teknisiä vaikeuksia (kaasukromatografian ja massaspektrometrian käyttötarve).

Adenosiinideaminaasin aktiivisuuden mittaaminen on lupaavaa. Adenosiinideaminaasi on entsyymi, jota määritetään nivelnesteissä, sydänpussissa, askitesnesteessä tai aivo-selkäydinnesteessä. Adenosiinideaminaasin pääasialliset tuottajat ovat lymfosyytit ja monosyytit. Adenosiinideaminaasin aktiivisuuden määrittäminen biologisista nesteistä helpottaa tuberkuloottisen niveltulehduksen, imusolmukkeiden tuberkuloosin, tuberkuloottisen meningiitin ja tuberkuloottisen serosiitin diagnosointia.

Jotkin biokemialliset indikaattorit määritetään epäspesifisyytensä vuoksi vain leesion lähellä olevista biologisista nesteistä. Indikaattorien taso mitataan tuberkuliinin ihonalaisen tai ihonsisäisen annon jälkeen (yleensä ennen antoa ja 48 ja 72 tuntia sen jälkeen). Tämän jälkeen lasketaan markkerin tason nousun aste (prosentteina) suhteessa lähtötasoon.

Optimaalisesti elinspesifisen entsyymin transamidinaasin aktiivisuus määritetään virtsasta; sen esiintyminen havaitaan eri syistä johtuvissa munuaisvaurioissa. Transamidinaasin tutkiminen on perusteltua vain, jos tuberkuliinia annetaan ihon alle paikallisen tulehdusprosessin pahentamiseksi. Transamidinaasiaktiivisuus määritetään virtsasta aluksi ja 24–72 tuntia 50 TE tuberkuliinin annon jälkeen. Fermenturian lisääntyminen kaksinkertaiseksi tai enemmän mahdollistaa 82 %:ssa tapauksista munuaisten aktiivisen tuberkuloosin erottamisen kroonisen pyelonefriitin pahenemisesta.

Naisten sukupuolielinten tuberkuloosissa haptoglobiinin ja malondialdehydin pitoisuudet veressä määritetään provokatiivisen tuberkuliinitestin olosuhteissa. Tuberkuliinia annetaan ihon alle annoksella 50 TE ja toistetaan biokemiallinen tutkimus 72 tunnin kuluttua. Tuberkuloottisen etiologian tapauksessa haptoglobiinipitoisuuden nousu on vähintään 28 % ja malondialdehydin pitoisuus on 39 % tai enemmän. Käytetään myös adenosiinideaminaasin aktiivisuuden määrittämistä Douglas-pussista saadusta vatsaontelonesteestä. Punktio tutkitaan uudelleen 72 tuntia tuberkuliinin ihonsisäisen annon jälkeen annoksilla 0,1 TE ja 0,01 TE etuvatsan seinämään sisäisten sukupuolielinten projektioalueelle. Adenosiinideaminaasin aktiivisuuden nousu 10 % tai enemmän alkuperäiseen arvoon verrattuna viittaa tuberkuloosiprosessiin.

Silmävaurion sattuessa tutkitaan silmässä antigeenin stimulaatioon reagoivaa fokaalista reaktiota. Tässä tapauksessa jyrkästi ilmentyneen vasteen kehittyminen, johon liittyy näkötoimintojen heikkeneminen, ei ole toivottavaa. Koska minimaalisten fokaalisten reaktioiden arviointi on usein vaikeaa, on suositeltavaa keskittyä rinnakkain haptoglobiinin tai adenosiinideaminaasin lisääntymisasteeseen veriseerumissa johtopäätöksen objektiivistamiseksi.

Kaikki biokemialliset tutkimukset tulisi suorittaa yhdessä muiden menetelmien kanssa.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Veren hyytymisjärjestelmän tutkimus

Veren hyytymisjärjestelmän tilan tutkimisen merkitys ftisiologiassa johtuu hemoptyysin eli keuhkoverenvuotojen esiintymisestä useilla keuhkotuberkuloosipotilailla sekä hemokoagulaatiokomplikaatioista tuberkuloosin kirurgisessa hoidossa. Lisäksi luonnostaan esiintyvä piilevä intravaskulaarinen hemokoagulaatio vaikuttaa taudin kulkuun ja kemoterapian tehokkuuteen.

Keuhkotuberkuloosipotilailla, joilla tulehduksessa on vallitseva eksudatiivinen komponentti, havaitaan veren antikoagulanttiaktiivisuuden vähenemistä. Potilailla, joilla on alhainen spesifisen keuhkovaurion esiintyvyys ja vallitseva tuottava tulehduksen komponentti, intravaskulaarinen hemokoagulaatio on merkityksetöntä. Keuhkotuberkuloosipotilailla, joilla on hemoptyysiä ja keuhkoverenvuotoja, veren hyytymisjärjestelmän tila on erilainen: potilailla, joilla on vähäinen verenhukka hemoptoeen huipulla tai välittömästi sen lopettamisen jälkeen, veren hyytymiskyky kasvaa jyrkästi trombiinin muodostumisprosessien voimakkaan tehostumisen vuoksi samalla, kun "rakenteellinen" hyytyvyys säilyy. Massiivisen verenhukan omaavilla potilailla havaitaan hyytymispotentiaalin laskua fibrinogeenin pitoisuuden, tekijä XIII -aktiivisuuden ja verihiutaleiden määrän vähenemisen vuoksi. Kirurgisen hoidon vaiheessa potilailla, joilla on rajoitettuja keuhkotuberkuloosimuotoja, ei esiinny merkittäviä homeostaasijärjestelmän häiriöitä. Laajoja prosesseja sairastavilla potilailla pneumonektomiaa tai pleuropneumonektomiaa suoritettaessa kehittyy usein DIC-oireyhtymä, joka voi ilmetä "toisen sairauden" muodossa.

Veren hyytymisjärjestelmän tilan seuraamiseksi keuhkotuberkuloosia sairastavilla potilailla on tarpeen määrittää aktivoitu osittainen tromboplastiiniaika (APTT), fibrinogeeni, trombiiniaika, protrombiini-indeksi sekä verenvuotoaika ja veren hyytymisaika.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Hormonaaliset tutkimukset

Nykyaikaiset kokeelliset ja kliiniset havainnot osoittavat hormonaalisen tilan muutoksia spesifisissä keuhkojen tuberkuloottisissa tulehduksissa. On osoitettu, että aivolisäke-lisämunuaisen, aivolisäke-kilpirauhasjärjestelmien ja haiman toimintahäiriöiden korjaaminen yhdessä tuberkuloosilääkityksen kanssa edistää fibrogeneesin ja korjausprosessien aktivoitumista spesifisen tulehduksen keskittymässä.

Aivolisäke-kilpirauhasjärjestelmän toiminnallinen tila arvioidaan veren seerumin trijodityroniinin (T3), tyroksiinin (T4) ja aivolisäkkeen tyreotropiinin (TSH) pitoisuuksien perusteella _. On _todettu, että subkliininen kilpirauhasen vajaatoiminta havaitaan 38–45 %:lla keuhkotuberkuloosipotilaista, ja se diagnosoidaan useimmiten prosessin disseminoituneissa ja fibroosi-kavernoottisissa muodoissa. Näissä muodoissa sekä T3:n että T4:n pitoisuudet laskevat jyrkimmin _, ja näiden hormonien _{epätasapaino ilmenee T4/} T3 _-suhteen nousuna.

Lisämunuaisten kuoren toimintaa arvioidaan seerumin kortisolipitoisuudella ja haiman umpieritystoimintaa immunoreaktiivisen insuliinin pitoisuudella. Tartuntataudin akuutissa vaiheessa endogeenisen kortisolin ja insuliinin tarve kasvaa. Hyperinsulinemia osoittaa myös kehon kudosten insuliiniresistenssiä, mikä on tyypillistä mille tahansa aktiiviselle tulehdusprosessille, erityisesti tietylle sellaiselle. Lisämunuaisten glukokortikoiditoiminnan määrittäminen aktiivisessa keuhkotuberkuloosissa mahdollistaa hyperkorttismin havaitsemisen useimmilla potilailla. Normaaleja veren kortisolipitoisuuksia potilaalla, jolla on tarttuva tulehdus akuutissa vaiheessa, tulisi pitää lisämunuaisten kuoren glukokortikoiditoiminnan suhteellisena vajaatoimintana, mikä voi toimia perustana korvaushoidolle riittävillä glukokortikoidiannoksilla.

Lähes kolmanneksella keuhkotuberkuloosipotilaista on alhainen insuliinipitoisuus, joka lähestyy normin alarajaa, kun taas 13–20 prosentilla on merkittävää hyperinsulinismia. Sekä suhteellinen hypo- että hyperinsulinismi ovat merkittäviä riskitekijöitä vaihtelevan vaikeusasteen hiilihydraattiaineenvaihdunnan häiriöiden kehittymiselle. Nämä haiman B-solujen toiminnallisen aktiivisuuden muutokset edellyttävät säännöllistä verensokerin seurantaa tuberkuloosipotilailla ja diabeteksen oikea-aikaista ehkäisyä. Lisäksi tämä toimii lisäperusteluna fysiologisten insuliiniannosten käytön tarkoituksenmukaisuudelle tuberkuloosin monimutkaisessa hoidossa.

Yleisesti ottaen kilpirauhashormonien pitoisuuksien lasku, niiden epätasapaino, hyperkortisolemia ja hyperinsulinismi ovat voimakkaimpia potilailla, joilla on vaikea tuberkuloosiprosessi, jolla on laajat keuhkovauriot ja voimakkaat tuberkuloosimyrkytyksen oireet.

Tuberkuloosin mikrobiologinen diagnostiikka

Mikrobiologiset tutkimukset ovat välttämättömiä tuberkuloosipotilaiden tunnistamiseksi, diagnoosin varmistamiseksi, kemoterapian seurannaksi ja korjaamiseksi sekä hoitotulosten arvioimiseksi eli siitä hetkestä lähtien, kun tuberkuloosipotilas rekisteröidään, siihen asti, kun hänet poistetaan rekisteristä.

Kaikki epidemiologiset ohjelmat ja hankkeet perustuvat bakteerien erittäjien määrän arviointiin, mikä on mahdotonta tehdä ilman laboratoriomenetelmiä tuberkuloosimykobakteerien havaitsemiseksi. Niin sanotun järjestäytymättömän väestön vetovoimaa tarkasteltaessa bakteerien erittäjien prosenttiosuus on 70 tai enemmän, mikä tekee laboratoriomenetelmistä melko tehokkaan tavan tunnistaa tuberkuloosipotilaita tässä väestöryhmässä.

Perinteisiä mikrobiologisia menetelmiä tuberkuloosin diagnosoimiseksi ovat bakterioskooppiset ja viljelytutkimukset. Nykyaikaisiin menetelmiin kuuluvat tuberkuloosimykobakteerien viljely automatisoiduissa järjestelmissä ja PCR. Kaikki nämä menetelmät yhdistetään kuitenkin välttämättä klassisiin bakteriologisiin menetelmiin.

Diagnostisen materiaalin kerääminen

Laboratoriokokeiden tehokkuus riippuu pitkälti diagnostisen materiaalin laadusta. Diagnostisen materiaalin keräämistä, säilytystä ja kuljetusta koskevien sääntöjen noudattaminen sekä potilaan tutkimusalgoritmin tarkka toteutus vaikuttavat suoraan tulokseen ja varmistavat biologisen turvallisuuden.

Tuberkuloosin testaamiseen käytetään useita erilaisia materiaaleja. Koska keuhkotuberkuloosi on yleisin tuberkuloositartunnan muoto, tärkeimpänä testattavana materiaalina pidetään ysköstä ja muita henkitorven ja keuhkoputkien eritteitä: ylähengitysteiden eritteitä aerosolien inhalaation jälkeen: keuhkoputkien huuhteluvesiä; keuhkoputkien huuhteluaineita; keuhkoputken tähystyksen, transtrakeaalisen ja keuhkon sisäisen biopsian aikana saatuja näytteitä: keuhkoputken aspiraattia, kurkunpään irtosolunäytteitä, eritteitä, haavanäytteitä jne.

Tutkimuksen tehokkuus paranee, jos potilaalta kerätään kontrolloidusti aineistoa. Tätä varten varataan erityisvarusteltu huone tai hankitaan erityisiä koppeja. Materiaalin kerääminen on vaarallinen toimenpide, joten tutkimusmateriaali on kerättävä infektioturvallisuusmääräysten mukaisesti.

Mycobacterium tuberculosis -testausmateriaali kerätään steriileihin, tiiviisti kierrettävillä korkeilla varustettuihin injektiopulloihin ympäristön saastumisen estämiseksi ja kerätyn materiaalin suojaamiseksi kontaminaatiolta.

Diagnostisen materiaalin keräämiseen tarkoitettujen injektiopullojen on täytettävä seuraavat vaatimukset:

• on oltava valmistettu iskunkestävästä materiaalista;
• pitäisi sulaa helposti autoklaavissa;
• oltava riittävän tilavia (40–50 ml):
• on oltava leveä aukko ysköksen keräämiseksi (halkaisija vähintään 30 mm);
• oltava helppoja käsitellä, läpinäkyviä tai läpikuultavia, jotta kerätyn näytteen määrä ja laatu voidaan arvioida avaamatta kantta.

Optimaalisten tutkimustulosten saamiseksi seuraavien ehtojen on täytyttävä:

• materiaalin kerääminen tulee suorittaa ennen kemoterapian aloittamista;
• tutkimusmateriaali on kerättävä ennen ruokailua tai lääkkeiden ottamista aamulla;
• Tutkimusta varten on suositeltavaa kerätä vähintään 3 aamuista yskösnäytettä. Ysköstä kerätään 3 peräkkäisenä päivänä;
• Kerätty materiaali on toimitettava laboratorioon mahdollisimman pian:
• tapauksissa, joissa materiaalia ei voida toimittaa laboratorioon välittömästi, sitä säilytetään jääkaapissa 4 °C:n ilman lämpötilassa enintään 48 tuntia;
• Materiaalia kuljetettaessa on kiinnitettävä erityistä huomiota pullojen eheyteen.

Oikein kerätyllä ysköksellä on limaista tai mukopurulenttia luonnetta. Tutkittavan ysköksen osan optimaalinen tilavuus on 3–5 ml.

Ysköksen kerääminen tapahtuu terveydenhuollon työntekijän valvonnassa. Ysköksen keräämisestä vastaavien henkilöiden on varmistettava, että tiettyjä sääntöjä noudatetaan:

• Potilaalle on tarpeen selittää tutkimuksen tarkoitus ja tarve yskiä pois syljen tai nenänielun liman sijaan, vaan hengitysteiden syvien osien sisältöä. Tämä voidaan saavuttaa useiden (2-3) syvän hengityksen jälkeen ilmaantuvan liman avulla. On myös tarpeen varoittaa potilasta, että hänen on ensin huuhdeltava suunsa kiehuvalla vedellä poistaakseen suuontelossa kasvavan mikroflooran pääosan ja ruokajäämät, jotka vaikeuttavat ysköksen tutkimusta;
• Ysköksen keräämiseen osallistuvan lääkintätyöntekijän on käytettävä suojavaatetuksen ja -hatun lisäksi maskia, kumikäsineitä ja kumiesiliinaa;
• Potilaan takana seisoessaan häntä kehotetaan pitämään pulloa mahdollisimman lähellä huuliaan ja erottamaan yskös välittömästi siihen yskiessään, samalla kun on varmistettava, että ilmavirtaus suuntautuu poispäin terveydenhuollon työntekijästä:
• Kun ysköksen keräys on valmis, terveydenhuollon työntekijän tulee sulkea pullo huolellisesti kannella ja arvioida kerätyn ysköksen määrä ja laatu. Sitten pullo merkitään ja laitetaan erityiseen laatikkoon laboratorioon kuljetusta varten.

Jos potilas ei eritä ysköstä, hänelle tulee antaa ysköstä irrottavaa lääkettä edellisenä iltana ja näytteenottopäivänä aikaisin aamulla: rohtovaahteran juuriuutetta (mukaltiinia), bromheksiiniä, ambroksolia jne. - tai käyttää ärsyttävää inhalaatiota käyttäen ysköksen keräämiseen tarkoitettua laitteistoa. Tällä tavoin kerättyä ainetta ei säilytetä, ja se tulee tutkia näytteenottopäivänä. Jotta vältettäisiin sen "hylkääminen" laboratoriossa, lähetteeseen tulee tehdä erityinen merkintä.

Jos mikrobiologisia tutkimuksia ei tehdä tietyssä laitoksessa, kerätty diagnostinen materiaali on toimitettava laboratorioon keskitetysti edellyttäen, että materiaali säilytetään toimitusten välillä jääkaapissa tai säilöntäaineiden kanssa. Materiaali toimitetaan laboratorioon kuljetuslaatikoissa, jotka voidaan helposti desinfioida. Jokainen näyte on varustettava asianmukaisella etiketillä, ja koko erän mukana on oltava täytetty saatelomake.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Potilaiden tutkimustavat ja -tiheys

Potilaan tuberkuloosin alkuvaiheen, niin sanotun diagnostisen, tutkimuksen aikana on tarpeen tutkia vähintään 3 annosta ysköstä, jotka on kerätty lääkintähenkilöstön valvonnassa 2 tai 3 päivän aikana, mikä lisää mikroskopian tehokkuutta.

Tuberkuloosin ensisijainen seulonta tulisi suorittaa kaikissa terveydenhuoltojärjestelmän lääketieteellisissä ja diagnostisissa laitoksissa. Viime aikoina kliinisten diagnostisten laboratorioiden pohjalta on perustettu niin sanottuja mikroskopiakeskuksia perustutkimuksen tehostamiseksi, ja ne on varustettu nykyaikaisilla mikroskoopeilla ja laitteilla epidemian turvallisuuden varmistamiseksi.

Tuberkuloosin vastaiset laitokset käyttävät tutkimusjärjestelmää, jossa ysköstä tai muusta diagnostisesta materiaalista tehdään vähintään kolminkertainen tutkimus kolmen päivän kuluessa. Hoidon aikana mikrobiologisia tutkimuksia tehdään säännöllisesti vähintään kerran kuukaudessa intensiivisen kemoterapian vaiheessa. Seurantavaiheeseen siirryttäessä tutkimuksia tehdään harvemmin - 2-3 kuukauden välein, kun taas tutkimusten tiheys vähennetään kahteen.

Diagnostisen materiaalin keräämisen ominaisuudet keuhkojen ulkopuoliselle tuberkuloosille

Patologisen materiaalin ominaisuus tuberkuloosin ekstrapulmonaalisissa muodoissa on mykobakteerien tuberkuloosin alhainen pitoisuus siinä, mikä vaatii herkempiä mikrobiologisia tutkimusmenetelmiä, ensisijaisesti ravintoalustaan kylvämisen menetelmiä.

Virtsatietuberkuloosin yhteydessä virtsa on helpoimmin saatavilla oleva tutkimusmateriaali. Virtsankeräyksen tulee suorittaa erikoiskoulutuksen saanut sairaanhoitaja.

Ulkoiset sukupuolielimet pestään vedellä ja saippualla tai laimealla kaliumpermanganaattiliuoksella. Virtsaputken ulkoinen aukko käsitellään huolellisesti. Aamuvirtsan keskiosa kerätään steriiliin pulloon: miehillä - luonnollisesti, naisilla - katetrin avulla. Munuaisaltaan virtsa kerätään steriileihin koeputkiin yhden tai kahden munuaisen katetroinnin aikana, jälkimmäisessä tapauksessa - välttämättä erikseen kummastakin munuaisesta. Pieni määrä tätä virtsaa sentrifugoidaan ja sedimenttiä tutkitaan.

Miehillä siittiöt, kivesten punktiot ja eturauhasen eritteet sentrifugoidaan sedimentin saamiseksi. Jos miehillä on sukupuolielinten alueella tietty prosessi, eturauhasen hieronta voi edistää tuberkuloosimykobakteereja sisältävien eritteiden vapautumista.

Kuukautisveri kerätään naisilta imulla tai Kafka-korkin avulla. Tuloksena oleva materiaali vapautetaan punasoluista pesemällä se tislatulla vedellä ja sentrifugoimalla. Sedimentti tutkitaan.

Kohdun kohdunkaulan kanavan erite kerätään johonkin astiaan tai Kafka-korkkiin, eli on toivottavaa kerätä 1-2 ml patologista materiaalia.

Munuaisiin, sukupuolielimiin, biopsioihin ja kohdun limakalvon kaapimiseen liittyvien kirurgisten toimenpiteiden aikana saatu materiaali homogenisoidaan. Tätä varten se asetetaan steriiliin mortteliin ja murskataan perusteellisesti steriileillä saksilla. Tuloksena olevaan suspensioon lisätään steriiliä jokihiekkaa sen massaa vastaava määrä, sitten lisätään 0,5–1,0 ml isotonista natriumkloridiliuosta ja kaikki jauhetaan, kunnes muodostuu mössöinen massa lisäämällä isotonista natriumkloridiliuosta (4–5 ml). Sitten massan annetaan laskeutua 1–1,5 minuuttia ja supernatantti tutkitaan.

Luiden ja nivelten tuberkuloosi. Steriilillä ruiskulla otettu punktio (paiseesta peräisin oleva mätänäyte) asetetaan steriiliin astiaan ja toimitetaan välittömästi laboratorioon. Steriilillä pipetillä, joka on kostutettu steriilillä isotonisella natriumkloridiliuoksella, otetaan 2–5 ml mätää, siirretään pulloon, jossa on helmiä, ja lisätään vielä 2–3 ml isotonista natriumkloridiliuosta. Pullo suljetaan tulpalla ja ravistetaan ravistimessa 8–10 minuuttia. Homogenisoitu suspensio tutkitaan.

Fistuloosissa luu-niveltuberkuloosin muodoissa fistulasta otetaan mätää. Runsas erite kerätään suoraan koeputkeen. Jos mätää on niukasti, fistulan tie pestään steriilillä isotonisella natriumkloridiliuoksella ja koeputkeen tai mätään kastettuun tamponinpalaan kerätyt huuhteluliuokset lähetetään tutkimukseen.

Luiden ja nivelten kirurgisten toimenpiteiden aikana saatu kirurginen materiaali voi koostua märkivä-nekroottisista massoista, rakeista, arpikudoksesta, luukudoksesta, nivelkalvokudoksesta ja muista substraateista. Sen käsittely suoritetaan kuten munuaistuberkuloosin tapauksessa.

Nivelnesteen mikrobiologinen tutkimus 3-prosenttisessa natriumsitraattiliuoksessa (suhteessa 1:1) hyytymisen estämiseksi suoritetaan välittömästi punktion jälkeen.

Imusolmukkeiden tuberkuloosi. Imusolmukkeiden punktiossa uutettua mätää tutkitaan samalla tavalla kuin paiseista peräisin olevaa mätää. Kirurgisten toimenpiteiden ja biopsioiden aikana otettua imusolmukekudosta tutkitaan kuten muissakin tuberkuloosityypeissä.

Mycobacterium tuberculosis -bakteerin ulosteiden tutkimus suoritetaan erittäin harvoin, koska positiivisia tuloksia ei ole lähes lainkaan.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Mykobakteerien mikroskopia

Ysköksen mikroskopia on suhteellisen nopea, yksinkertainen ja edullinen menetelmä, jota tulisi käyttää kaikissa tuberkuloosiepäilytapauksissa. Lisäksi tätä tutkimusta tehdään kemoterapian tehokkuuden arvioimiseksi ja toipumisen tai hoidon epäonnistumisen varmistamiseksi ilman viljelytuloksia.

Mikroskooppisessa tutkimuksessa käytetään kahta menetelmää:

• suora mikroskopiamenetelmä, jossa näyte valmistetaan suoraan diagnostisesta materiaalista;
• kulttuuritutkimusta varten tarkoitettu dekontaminointiaineilla käsitellystä materiaalista valmistetun sedimentin mikroskopiamenetelmä.

Ensimmäistä menetelmää käytetään niissä laboratorioissa, joissa tehdään vain mikroskooppisia tutkimuksia (yleisen lääketieteellisen verkon kliiniset diagnostiset laboratoriot).

Mikroskooppisen tutkimuksen parhaat tulokset saadaan diagnostisen materiaalin konsentroimalla (esimerkiksi sentrifugoimalla).

Jotta Mycobacterium tuberculosis voidaan havaita mikroskopialla 50 %:n todennäköisyydellä, 1 ml:n ysköstä on sisällettävä yli 5 000 mikrobisolua. Keuhkotuberkuloosia sairastavien potilaiden ysköksissä on yleensä merkittävä määrä haponkestäviä bakteereja, minkä ansiosta ne voidaan havaita luotettavasti bakterioskopialla. Menetelmän diagnostista herkkyyttä voidaan lisätä tutkimalla useita yskösnäytteitä samalta potilaalta. Negatiivinen bakterioskooppinen tutkimustulos ei sulje pois tuberkuloosidiagnoosia, koska joidenkin potilaiden ysköksessä on vähemmän Mycobacterium-bakteereja kuin mikroskopialla voidaan havaita. Myös yskösnäytteiden huono valmistus voi olla negatiivisen bakterioskooppisen tutkimustuloksen syynä.

Yleisin menetelmä haponkestävien mykobakteerien havaitsemiseksi sivelynäytteestä on Ziehl-Neelsen-värjäys. Menetelmä perustuu karbolifuksiinin tunkeutumiseen mikrobisoluun vaha-lipidikerroksen sisältävän kalvon läpi, samanaikaisesti lämmityksen ja fenolin voimakkaan syövytysvaikutuksen kanssa. Sivelynäytteen myöhempi värjäys 25-prosenttisella rikkihappoliuoksella tai 3-prosenttisella suolahappoalkoholiliuoksella johtaa kaikkien ei-haponkestävien rakenteiden värjäytymiseen. Sivelynäytteen värjäytyneet elementit värjätään 0,3-prosenttisella metyleenisiniliuoksella. Mykobakteerit eivät siedä tavanomaisia aniliiniväriaineita, minkä seurauksena haponkestävät mykobakteerit värjäytyvät vadelmanpunaisiksi ja muut mikrobit ja soluelementit sinisiksi.

Ziehl-Neelsenin menetelmällä värjättyjen sivelynäytteiden tutkimiseen käytetään valobinokulaarista mikroskooppia, jossa on immersio-objektiivi (90- tai 100-kertainen suurennus) ja okulaari, jossa on 7- tai 10-kertainen suurennus. Tutkitaan 100 näkökenttää, mikä riittää yksittäisten mykobakteerien havaitsemiseen sivelynäytteestä. Jos tällaisen tutkimuksen tulos on negatiivinen, on suositeltavaa tutkia vielä 200 näkökenttää vahvistuksen saamiseksi. Tulokset kirjataan ja ilmoitetaan havaittujen haponkestävien mykobakteerien (AFB) lukumäärä.

Tämän menetelmän lisäksi luminesoivassa mikroskopiassa käytetään fluorokromivärjäystä, jolla saavutetaan parhaat tulokset. Tämän menetelmän käyttö lisää mikroskopian tehokkuutta 10–15 %. Kun mykobakteereja käsitellään luminoivilla väriaineilla (auramiini, rodamiini jne.), nämä aineet sitoutuvat myös mikrobisolun vahamaisiin rakenteisiin. Kun värjättyjä soluja säteilytetään virittävällä valonlähteellä (tietty ultraviolettisäteilyn spektri), ne alkavat hehkua oranssina tai kirkkaan punaisena mustaa tai tummanvihreää taustaa vasten. Näkyvän kuvan suuren kirkkauden ja kontrastin ansiosta mikroskoopin kokonaissuurennusta voidaan pienentää 4–10-kertaisesti, mikä laajentaa näkökenttää ja lyhentää valmisteen katseluaikaa. Samalla huomattavasti suuremman syväterävyyden ansiosta tutkimuksen mukavuutta voidaan lisätä.

Fluoresenssimikroskopiaa käytettäessä saman sivelynäytteen alueen tarkastelu kestää huomattavasti vähemmän aikaa kuin Ziehl-Neelsenin menetelmällä värjättyjen sivelynäytteiden valomikroskopia. Jos mikroskopioitsija tarkastelee työpäivän aikana noin 20–25 tällaista sivelynäytettä, niin fluoresenssimikroskopian avulla hän voi tutkia yli 60–80 näytettä samassa ajassa. Kokeneet mikroskopioitsijat tietävät, että solujen värjäys auramiinin ja rodamiinin seoksella on jollain tavalla spesifistä haponkestäville mykobakteereille, joilla tässä tapauksessa on kullanruskeiden sauvojen ulkonäkö. Saprofyytit värjäytyvät vihertäviksi.

Fluoresenssimikroskopiamenetelmän toinen tärkeä etu on kyky havaita muuttuneita mykobakteereja, jotka ovat menettäneet haponkestävät ominaisuutensa useiden epäsuotuisien tekijöiden, erityisesti intensiivisen kemoterapian, vaikutuksesta, eivätkä siksi havaita niitä Ziehl-Neelsen-värjäyksellä.

Fluoresenssimikroskopiamenetelmän haittapuoliin kuuluu mikroskoopin ja sen käytön suhteellisen korkeat kustannukset. Keskitetyissä tai muissa suurissa laboratorioissa, joissa työmäärä ylittää kolmen laboratorioteknikon työskentelyn kolmen perinteisen mikroskoopin kanssa, on kuitenkin halvempaa käyttää yhtä fluoresenssimikroskooppia.

Bakterioskooppisilla menetelmillä on melko korkea spesifisyys (89–100 %). Noin 97 % millä tahansa mikroskopiamenetelmällä saaduista positiivisista tuloksista vahvistetaan selvästi kylvötulosten perusteella.

On huomattava, että patologisen materiaalin sivelynäytteen mikroskooppinen tutkimus ei mahdollista havaittujen haponkestävän mykobakteerin lajin määrittämistä. Mikroskooppinen menetelmä mahdollistaa vain johtopäätöksen tekemisen haponkestävän mikro-organismin esiintymisestä tai puuttumisesta valmisteessa, mikä selittyy sillä, että luonnossa esiintyy suuri määrä ei-tuberkuloosimaisia haponkestävän mikro-organismeja, jotka ovat morfologisesti samanlaisia kuin tuberkuloosikompleksin mykobakteerit.

Mikroskopiatulosten arviointi suoritetaan semikvantitatiivisina yksiköinä.

Eri mikroskopiamenetelmien tulosten vertailemiseksi otetaan käyttöön empiirisiä kertoimia. Esimerkiksi fluoresoivilla väriaineilla värjätyn siveltimen tulosten vertaamiseksi valomikroskopiatutkimuksen (1000-kertainen suurennus) tietoihin on tarpeen jakaa fluoresenssimikroskoopilla havaittujen haponkestävien mykobakteerien lukumäärä vastaavalla kertoimella: mikroskoopin 250-kertaisella suurennuksella - 10:llä, 450-kertaisella - 4:llä, 630-kertaisella - 2:lla.

Mikroskopian ominaisuudet keuhkojen ulkopuolisessa tuberkuloosissa

Suoraa mikroskopiaa käytetään sekä rikastuksen jälkeen valmistettujen irtonäytteiden mikroskopiassa ja sen jälkeen Ziehl-Neelsenin tai fluoresoivien väriaineiden värjäyksessä. Irtonäytteiden suora mikroskopia on tehotonta materiaalin alhaisen mykobakteeripitoisuuden vuoksi, ja siksi on järkevämpää käyttää rikastusmenetelmiä. Sentrifugointi on tehokkain menetelmä. Jos biologinen materiaali on viskoosia, käytetään sentrifugointia, jossa materiaali homogenisoidaan ja nesteytetään samanaikaisesti. Tämä suoritetaan käyttämällä suurnopeussentrifugeja, joiden sentrifugointivoima on 3000 g, ja hypokloriittiliuoksia. Muita rikastusmenetelmiä, kuten mikroflotaatiota, ei tällä hetkellä käytetä biologisesti vaarallisten aerosolien muodostumisen vuoksi.

[ 37 ]

Viljelymenetelmä tuberkuloosin diagnosoimiseksi

Viljelymenetelmä eli kylvömenetelmä on herkempi kuin sivelymikroskooppi ja sillä on useita etuja jälkimmäiseen verrattuna. Sen avulla voidaan havaita useita kymmeniä elinkelpoisia mykobakteereja tutkittavasta materiaalista ja sillä on korkea diagnostinen arvo. Tämä on erityisen tärkeää tutkittaessa materiaalia äskettäin diagnosoiduilta tai hoidetuilta potilailta, joilla erittyy pieni määrä mykobakteereja.

Mikroskopiaan verrattuna viljelytutkimus mahdollistaa havaittujen tuberkuloosipotilaiden määrän lisäämisen yli 15–25 %:lla sekä tuberkuloosin varmentamisen aikaisemmissa vaiheissa, jolloin tauti on vielä helposti hoidettavissa. Viljelmätutkimuksen erittäin tärkeänä etuna pidetään mahdollisuutta saada taudinaiheuttajaviljelmä, joka voidaan tunnistaa ja tutkia lääkeherkkyyden, virulenssin ja muiden biologisten ominaisuuksien suhteen.

Viljelymenetelmien haittoja ovat niiden kesto (materiaalien odotusaika on 10 viikkoa), korkeammat kustannukset ja diagnostisen materiaalin käsittelyn monimutkaisuus.

Diagnostisen materiaalin kylvöä edeltävän käsittelyn periaatteet

Perinteisiä mikrobiologisia menetelmiä ei voida käyttää tuberkuloositestien suorittamiseen. Tämä johtuu siitä, että tuberkuloosimykobakteerit kasvavat hyvin hitaasti, ja useimmat kliiniset näytteet sisältävät nopeasti kasvavia märkäisiä ja mädäntäviä mikro-organismeja ja sieniä. Niiden nopea kasvu ravinteikkailla alustoilla häiritsee mykobakteerien kehitystä eikä mahdollista tuberkuloosipatogeenin eristämistä, joten diagnostinen materiaali on esikäsiteltävä ennen kylvöä. Lisäksi potilaan hengitysteistä vapautuvat mykobakteerit ovat yleensä ympäröityjä suurella määrällä limaa, mikä vaikeuttaa niiden väkevöimistä. Siksi ennen ysköksen ja muiden vastaavien materiaalien kylvöä ne on nesteytettävä ja puhdistettava.

Kaikilla pesuaineilla ja puhdistusaineilla on enemmän tai vähemmän voimakas myrkyllinen vaikutus mykobakteereihin. Käsittelyn seurauksena jopa 90 % mykobakteereista voi kuolla. Riittävän osan mykobakteerikannan säilyttämiseksi on käytettävä hellävaraisia käsittelymenetelmiä, jotka mahdollistavat toisaalta nopeasti kasvavien mädäntyvien ja mädäntyvien mikro-organismien tukahduttamisen ja toisaalta materiaalissa olevien mykobakteerien elinkelpoisuuden maksimoinnin.

Materiaalista, sen homogeenisuudesta ja kontaminaatioasteesta riippuen esikäsittelyssä käytetään erilaisia dekontaminointiaineita: yskökselle - 4 % natriumhydroksidiliuosta, 10 % trinatriumfosfaattiliuosta, bentsalkoniumkloridi-trinatriumfosfaattia, NALC-NaOH:ta (N-asetyyli-L-kysteiini-natriumhydroksidi), jonka lopullinen NaOH-pitoisuus on 1 %, virtsalle ja muille nestemäisille materiaaleille - 3 % rikkihappoliuosta, kontaminoituneille näytteille, rasvaa sisältäville materiaaleille - oksaalihappoliuosta, jonka pitoisuus on enintään 5 %. Lisäksi joissakin tapauksissa käytetään entsyymejä ja pinta-aktiivisia aineita (pesuaineita). Tweenin ja joidenkin muiden pesuaineiden käyttöön liittyy mykobakteerisolujen vähäisempi kuolema (40–50 % selviää). Niitä voidaan kuitenkin käyttää vain nestemäisille materiaaleille. NALC-NaOH, jota tuotetaan pakkauksina, on maailman laajimmin käytetty menetelmä. Tämän menetelmän avulla voidaan eristää yli 85 % mykobakteerisolupopulaatiosta. Kudospitoisten kiinteiden materiaalien dekontaminaatio on vaikeampaa, koska materiaalin dispersioastetta on vaikea arvioida homogenisoinnin aikana. Esimerkiksi imusolmukebiopsioiden käsittelyyn liittyy usein lisääntynyt kontaminaatio vieraalla bakteerikannalla. Tässä tapauksessa voidaan käyttää 1-prosenttista etoniumia.

Epähomogeeninen materiaali homogenisoidaan lasihelmillä dekontaminointiaineiden läsnä ollessa. Nestemäiset materiaalit esisentrifugoidaan ja vain sedimentti käsitellään.

Kylvö- ja inkubointitekniikka

Esikäsittelyn jälkeen materiaali sentrifugoidaan, mikä saostaa mykobakteerit ja lisää niiden pitoisuutta sedimentissä ("sedimentin rikastuminen"). Tuloksena oleva sedimentti neutraloidaan ja inokuloidaan tiheän ravintoalustan tai nestemäisen (puolinestemäisen) alustan pinnalle. Jäljelle jääneestä sedimentistä valmistetaan mikroskooppista tutkimusta varten tarkoitetut sivelynäytteet. Kylvötekniikan on estettävä diagnostisen materiaalin ristikontaminaatio.

Mikrobiologisen tutkimuksen tulosten luotettavan kliinisen tulkinnan varmistamiseksi on noudatettava seuraavaa sääntöä: mikroskooppiset ja viljelytutkimukset on suoritettava rinnakkain samasta diagnostisen materiaalin näytteestä.

Inokuloidut putket asetetaan termostaattiin 37 ^° C:seen kahdeksi päiväksi vaakasuoraan asentoon. Tämä varmistaa materiaalin tasaisemman imeytymisen ravintoalustaan. Kahden päivän kuluttua putket siirretään pystysuoraan asentoon ja suljetaan ilmatiiviisti kumi- tai silikonitulpilla, jotta kylvetty alusta ei kuivu.

Kasveja pidetään termostaatissa 37 ^° C:ssa 10–12 viikon ajan ja niitä tarkastetaan säännöllisesti viikoittain. Seuraavat parametrit kirjataan jokaisella tarkastuskerralla:

• kylvöpäivästä alkava visuaalisesti havaittavan kasvun ajanjakso;
• kasvuvauhti (pesäkemuodostelmien lukumäärä);
• viljelmän saastuminen vieraalla mikrobiflooralla tai sienillä (tällaiset koeputket poistetaan);
• ei näkyvää kasvustoa. Putket jätetään termostaattiin seuraavaan tarkastukseen asti.

Ravinnemedia

Mykobakteerien viljelyyn käytetään erilaisia ravinnealustoja: kiinteitä, puolinestemäisiä ja nestemäisiä. Millään tunnetuista ravinnealustoista ei kuitenkaan ole ominaisuuksia, jotka varmistaisivat kaikkien mykobakteerisolujen kasvun. Tässä suhteessa tehokkuuden parantamiseksi on suositeltavaa käyttää samanaikaisesti 2-3 eri koostumusta omaavaa ravinnealustaa.

WHO suosittelee Lowenstein-Jensen-elatusainetta tuberkuloosipatogeenin primaariseen eristämiseen ja sen lääkeherkkyyden määrittämiseen standardielatusaineena. Tämä on tiheä munaelatusaine, jossa mykobakteerien kasvua havaitaan 20.–25. päivänä bakterioskooppisesti positiivisen materiaalin kylvämisen jälkeen. Bakterioskooppisesti negatiivisen materiaalin kylväminen vaatii pidemmän inkubointiajan (jopa 10–12 viikkoa).

Maassamme ER Finnin ehdottama Finn-II-munakasvualusta on yleistynyt. Se eroaa siinä, että L-asparagiinin sijaan siinä käytetään natriumglutamaattia, joka käynnistää muita aminohappojen synteesireittejä mykobakteereissa. Kasvu alkaa tällä kasvualustalla jonkin verran aikaisemmin, ja mykobakteerien eristämisen tiheys on 6–8 % korkeampi kuin Lowenstein-Jensen-kasvualustalla.

Ekstrapulmonaalisen tuberkuloosin bakteriologisen diagnostiikan tehokkuuden lisäämiseksi on suositeltavaa sisällyttää ravinneliuoskompleksiin modifioitua Finn-II-elatusainetta. Kasvun kiihdyttämiseksi Finn-II-ravinneliuokseen lisätään lisäksi 0,05 % natriumtioglykolaattia, mikä vähentää happipitoisuutta. Mykobakteerien entsyymijärjestelmien suojaamiseksi lipidiperoksidaation myrkyllisiltä tuotteilta Finn-II-ravinneliuokseen lisätään antioksidanttia α-tokoferoliasetaattia 0,001 μg/ml pitoisuudella. Diagnostinen materiaali kylvetään standardimenetelmällä.

Venäjän tuberkuloosin vastaisissa laboratorioissa käytetään myös muita tiheiden ravintoalustojen muunnelmia: GG Mordovskin ehdottamaa Novaya-ravinnealustaa, V. Anikinin kehittämiä A-6- ja A-9-ravinnealustoja jne.

Koska kemoterapian aikana mikrobisolun erilaiset aineenvaihduntajärjestelmät vaurioituvat, osa mykobakteeripopulaatiosta menettää kyvyn kehittyä normaalisti tavanomaisilla ravintoalustoilla ja tarvitsee osmoottisesti tasapainotettuja (puolinestemäisiä tai nestemäisiä) ravintoalustoja.

Diagnostisen materiaaliviljelyn tulosten arviointi ja kirjaaminen

Jotkut mykobakteerikannat ja -tyypit kasvavat hitaasti, kasvua voi esiintyä jopa 90. päivänä. Tällaisten viljelmien määrä on pieni, mutta tämä pakottaa kylvöt pitämään termostaatissa 2,5–3 kuukautta.

Mycobacterium tuberculosis -bakteerin virulentit viljelmät kasvavat yleensä kiinteillä munamaisilla kasvualustoilla erikokoisina ja -näköisinä R-muotoisina pesäkkeinä. Pesäkkeet ovat kuivia, ryppyisiä, norsunluunvärisiä ja hieman pigmentoituneita. Muilla kasvualustoilla Mycobacterium tuberculosis -pesäkkeet voivat olla kosteampia. Kemoterapiakuurin jälkeen tai hoidon aikana voidaan eristää sileitä, kosteakasvuisia pesäkkeitä (S-muotoja).

Viljelmiä eristettäessä käytetään erityistutkimuksia tuberkuloosimykobakteerien erottamiseksi ei-tuberkuloosisista mykobakteereista ja haponkestävistä saprofyyteistä.

Positiivinen vastaus annetaan Ziehl-Neelsenin menetelmällä värjätyn kasvaneiden pesäkkeiden näytteen pakollisen mikroskooppisen tutkimuksen jälkeen. Mykobakteerien kasvun tapauksessa näytteissä näkyy kirkkaanpunaisia sauvoja, jotka sijaitsevat yksittäin tai ryhmissä muodostaen huovan tai punosten muotoisia klustereita. Nuorissa viljelmissä, erityisesti pitkään kemoterapiaa saaneiden potilaiden eristetyissä viljelmissä, mykobakteereille on ominaista voimakas polymorfismi, jopa lyhyiden, lähes kokoisten tai pitkänomaisten, sienirihmastoa muistuttavien varianttien sekä sauvamaisten muotojen esiintyminen.

Mykobakteerien kasvun intensiteetti määritetään seuraavan kaavan mukaisesti: (+) - 1–20 CFU koeputkessa (alhainen bakteerien eritys); (++) - 20–100 CFU koeputkessa (kohtalainen bakteerien eritys); (+++) - >100 CFU koeputkessa (runsas bakteerien eritys). Tuberkuloosin laboratoriodiagnostiikassa ei riitä, että antaa vastauksen siitä, onko mykobakteereja havaittu tietyllä menetelmällä. On myös tarpeen tietää yksityiskohtaisesti mykobakteeripopulaation määrä ja luonne, sen koostumus ja ominaisuudet. Näiden tietojen avulla voidaan tulkita prosessin tilaa oikein, suunnitella taktiikat ja säätää hoitoa ajoissa.

Viime vuosina on ehdotettu agar-pohjaisia ravinnealustoja, joissa on erilaisia kasvua edistäviä aineita, ja erityisen kaasuseoksen käyttöä mykobakteerien kasvun kiihdyttämiseksi. Mykobakteerien kasvun aikaansaamiseksi näillä alustoilla luodaan viljelyn aikana ilmakehä, jossa on lisääntynyt hiilidioksidipitoisuus (4-7 %). Tätä varten käytetään erityisiä CO2-inkubaattoreita _. Eniten ovat kuitenkin kehittyneet automatisoidut mykobakteerien viljelyjärjestelmät: MGIT-BACTEC-960 ja MB/Bact.

Yksi tällaisista järjestelmistä on MGIT (mykobakteerien kasvua indikoiva tube) -järjestelmä, joka on huipputeknologinen kehitystyö ja on suunniteltu tuberkuloosin nopeutettuun bakteriologiseen diagnostiikkaan ja mykobakteerien herkkyyden määrittämiseen ensilinjan lääkkeille ja joillekin toisen linjan lääkkeille. MGIT on suunniteltu käytettäväksi osana VASTEC-960-laitetta. Mikro-organismeja viljellään erityisissä koeputkissa nestemäisellä ravintoalustalla, joka perustuu modifioituun Middlebrook-7H9-elatusaineeseen. Mykobakteerien kasvun stimuloimiseksi ja vieraiden mikrofloorasolujen kasvun estämiseksi käytetään MGIT-kasvulisää ja PANTA-bakteerilääkkeiden seosta.

Mikro-organismien kasvu rekisteröidään optisesti. Se perustuu fluoresenssiin, jota tapahtuu, kun mykobakteerit kuluttavat happea kasvunsa aikana. Happiriippuvainen fluorokromiväriaine on erityisen koeputken pohjalla ja päällystetty silikonikerroksella. Mykobakteerien lisääntyminen johtaa happimäärän vähenemiseen koeputkessa ja sen pitoisuuden laskuun, mikä aiheuttaa fluoresenssin lisääntymistä, joka tulee näkyväksi, kun koeputkea säteilytetään ultraviolettivalolla, ja rekisteröidään automaattisesti VASTES-960-laitteeseen sisäänrakennetuilla valosensoreilla. Luminesenssin intensiteetti rekisteröidään kasvuyksiköissä (GU). Kasvutiedot syötetään automaattisesti tietokoneeseen, jossa ne voidaan tallentaa. Kasvukäyrien tietokonepohjainen analyysi voi antaa tietoa erilaisten mykobakteeripoolien, myös ei-tuberkuloosisten, esiintymisestä ja auttaa myös arvioimaan mykobakteerien kasvuominaisuuksia.

Tällaisten järjestelmien käyttöönoton seurauksena mykobakteerien kasvuaika on lyhentynyt merkittävästi, keskimäärin 11 päivää VASTEC-960-alustalla ja 19 päivää MB/Bact-alustalla verrattuna 33 päivään tavallisella tiheällä ravintoalustalla. On huomattava, että nämä järjestelmät vaativat erittäin pätevää henkilöstöä. Nestemäisille alustoille kylvö on välttämättä yhdistettävä kylvöön Löwenstein-Jensen-alustalle, joka toimii varalla tapauksissa, joissa tuberkuloosimykobakteerit eivät kasva muilla alustoilla.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Mykobakteerien lääkeherkkyyden määritys

Mykobakteerien spektrin ja herkkyysasteen määrittäminen tuberkuloosilääkkeille on erittäin kliinisesti tärkeää, samoin kuin lääkeresistentin tuberkuloosin leviämisen epidemiologisen arvioinnin kannalta. Lisäksi lääkeresistenssin seuranta mahdollistaa koko tuberkuloosin vastaisen ohjelman tehokkuuden arvioinnin, koska se on olennainen indikaattori kaikkien tuberkuloosin vastaisten toimenpiteiden osien toiminnasta.

Lääkeherkkyystestien tiheys ja ajoitus:

• ennen hoidon aloittamista, kerran hoitostrategian ja -taktiikan määrittämiseksi:
• Kun potilaan eri materiaaleista (yskös, BAL, virtsa, eritteet, aivo-selkäydinneste jne.) otetaan viljelmiä, kaikki eristetyt kannat tutkitaan:
• intensiivisen hoitovaiheen lopussa ilman kliinistä ja radiologista dynamiikkaa:
• jos hoito-ohjelmaa on tarpeen muuttaa seuraavissa tapauksissa:
  • ysköksen negatiivisuuden puuttuminen;
  • uudelleenviljely ysköksen negatiivisuuden jälkeen;
  • jyrkkä AFB-määrän nousu sivelynäytteessä alkuvaiheen laskun jälkeen. On hyvin tunnettua, että tuberkuloosipotilaan näytteestä eristetään Mycobacterium tuberculosis -kantoja, joilla on erilainen lääkeherkkyys. Kantojen herkkyys tuberkuloosilääkkeille voi vaihdella lääkekirjon, resistenssin kehittymisen asteen, tiheyden ja nopeuden suhteen.

Mycobacterium tuberculosis -bakteerin lääkeresistenssin aste määritetään vakiintuneiden kriteerien mukaisesti, jotka keskittyvät resistenssin kliiniseen merkitykseen ja riippuvat lääkkeen tuberkuloosinvastaisesta vaikutuksesta, sen farmakokinetiikasta, pitoisuudesta leesiossa, suurimmasta terapeuttisesta annoksesta jne.

Mykobakteerien lääkeherkkyyden määritys suoritetaan tällä hetkellä mikrobiologisilla menetelmillä:

• absoluuttiset pitoisuudet (laimennusmenetelmä kiinteällä tai nestemäisellä ravinnealustalla),
• mittasuhteet,
• vastuskerroin.

Yleensä resistenssi ilmenee visuaalisesti havaittavana mykobakteerien tuberkuloosipesäkkeiden kasvuna, mutta on olemassa menetelmiä, jotka indusoivat kasvua mykobakteerien solujen jakautumisen alkuvaiheessa värireaktioiden muodossa. Nämä menetelmät lyhentävät testiaikaa 3–4 viikosta 2 viikkoon.

WHO:n kemoterapiakomitean suosittelema absoluuttisen konsentraation menetelmä on yleistynyt Venäjällä yhtenäisenä menetelmänä. Metodologisesta näkökulmasta se on yksinkertaisin, mutta vaatii laboratoriomenetelmiltä korkeaa standardointia ja tarkkuutta. Lääkeherkkyystesti koostuu sarjasta koeputkia, joissa on tuberkuloosilääkkeillä modifioitua ravintoalustaa. Sarjaan kuuluu 2–3 koeputkea, joissa on eri pitoisuuksia kutakin käytettyä lääkettä, yksi kontrollikoeputki, jossa on lääkeaineetonta alustaa, ja yksi koeputki, joka sisältää 1000 μg/ml natriumsalisylaattia tai 500 μg/ml paranitrobentsoehappoa ei-tuberkuloottisten mykobakteerien kasvun havaitsemiseksi.

Valmisteilla varustetun väliainesarjan valmistamiseksi käytetään modifioitua Lowenstein-Jensen-väliainetta (ilman tärkkelystä), joka kaadetaan pulloihin. Jokaiseen pulloon lisätään tietty tilavuus vastaavaa laimennettua tuberkuloosilääkettä. Pullojen sisältö sekoitetaan huolellisesti, kaadetaan koeputkiin ja koaguloidaan kaltevalla paikalla 40 minuuttia 85 °C:n lämpötilassa. Väliaine on suositeltavaa koaguloida sähköisessä koagulaattorissa, jossa on automaattinen lämpötilan säätö. Väliaine tuberkuloosilääkkeillä

1. rivin lääkkeet voidaan säilyttää jääkaapissa 2–4 °C:ssa 1 kuukauden ajan, 2. rivin lääkkeiden kanssa enintään 2 viikkoa. Lääkeaineiden säilyttäminen huoneenlämmössä on mahdotonta. Tuberkuloosilääkkeiden liuoksia valmistettaessa otetaan huomioon niiden aktiivisuus ja pitoisuus lasketaan ottamalla huomioon lääkkeen epäspesifisen osan molekyylipaino, puhtaus jne. Lääkeherkkyyden määrittämiseksi käytetään vain kemiallisesti puhtaita aineita.

Menetelmän periaatteena on määrittää tuberkuloosilääkkeen pitoisuus, joka estää merkittävän osan mykobakteeripopulaation kasvua. Oikein suoritettuna menetelmällä on hyvä luotettavuus.

Ennen testin suorittamista on varmistettava, ettei eristetty Mycobacterium tuberculosis -viljelmä sisällä vieraita mikroflooraa. Mykobakteeriviljelmästä valmistetaan 0,9-prosenttisessa natriumkloridiliuoksessa homogeeninen suspensio, joka sisältää 500 miljoonaa mikrobia 1 ml:ssa (optinen sameusstandardi 5 yksikköä). Saatu suspensio laimennetaan 0,9-prosenttisella natriumkloridiliuoksella (1:10) ja 0,2 ml suspensiota lisätään jokaiseen ravintoalustasetin koeputkeen. Inokuloidut koeputket asetetaan 37 °C:een termosaattiin ja pidetään vaakasuorassa 2–3 päivän ajan, jotta ravintoalustan viisto pinta inokuloituu tasaisesti Mycobacterium tuberculosis -suspensiolla. Sitten koeputket siirretään pystysuoraan asentoon ja inkuboidaan 3–4 viikkoa. Tulokset kirjataan 3–4 viikon kuluttua.

Koska taudinaiheuttajan eristäminen kliinisestä materiaalista ravintoalustalla kestää vähintään 1–1,5 kuukautta, lääkeherkkyyden määrittämisen tulokset tällä menetelmällä voidaan saada aikaisintaan 2–2,5 kuukauden kuluttua materiaalin kylvämisestä. Tämä on yksi menetelmän tärkeimmistä haitoista.

Mykobakteerien lääkeherkkyystestien tuloksia tulkitaan tiettyjen kriteerien perusteella. Kiinteillä kasvualustoilla viljelmää pidetään herkänä kasvualustan sisältämän lääkeaineen pitoisuudelle, jos tietyssä lääkettä sisältävässä koeputkessa kasvavien mykobakteeripesäkkeiden määrä ei ylitä 20:tä ja kontrollikoeputkessa, jossa ei ole lääkkeitä, kasvu on runsasta. Vain jos pesäkkeitä on yli 20, viljelmää pidetään resistenttina tietylle pitoisuudelle. Käytännössä, kun kasvutulokset koeputkissa ovat lähes 20 pesäkettä muodostavaa yksikköä, on ilmoitettava kliiniselle yksikölle, että herkkyys tai resistenssi on tässä tapauksessa rajatapaus, koska tämä voi joskus selittää kliinisten indikaattoreiden epäselvän dynamiikan.

Erilaisille valmisteille vahvistetaan tietty pitoisuus, jolla havaitaan mykobakteeripopulaation kriittisen osan lisääntyminen. Näitä pitoisuuksia kutsutaan "kriittisiksi". Mykobakteeripopulaation kasvun suuruutta ravintoalustalla, jossa valmiste on kriittisessä pitoisuudessa, käytetään stabiilisuuden kriteerinä.

Kotimaisessa ftiisiologian käytännössä lääkeresistenssiä määritettäessä ei rajoituta pelkästään kriittisten pitoisuuksien määrittämiseen. Tämä johtuu siitä, että taudinaiheuttajan lääkeresistenssin tason laajennettu määritelmä antaa lääkärille mahdollisuuden laatia kemoterapiataktiikoita tarkemmin, hyödyntäen tietoa lääkeyhdistelmien voimistavasta vaikutuksesta, ennakoida ristiresistenssiä tai käyttää tehokkaampia lääkkeitä käytetystä tuberkuloosilääkkeiden ryhmästä.

Absoluuttinen konsentraatiomenetelmä on yksinkertaisin, mutta myös herkin sen toteutuksessa tehtäville virheille. Luotettavampi, erityisesti toisen linjan lääkkeiden herkkyyttä määritettäessä, ja Venäjän ulkopuolella laajalle levinnyt on suhteellinen menetelmä. Se ottaa huomioon absoluuttisen konsentraatiomenetelmän puutteet, mutta sen toteuttaminen on työläämpää.

Menetelmä on hyvin samankaltainen kuin absoluuttisen konsentroinnin menetelmä. Lääkeaineiden sisältämien koeputkien valmistus on sama kuin absoluuttisen konsentroinnin menetelmässä. Tuberkuloosimykobakteerisuspension siemenannosta kuitenkin pienennetään 10 kertaa, mikä eliminoi joidenkin tuberkuloosimykobakteerikantojen spontaanin resistenssin esiintymistiheyden lääkkeille, kuten etambutolille, protionamidille ja kapreomysiinille. Kontrollina käytetään 2 tai 3 putkea, joiden siemenannos on yhtä suuri kuin koeputkissa oleva annos, ja jotka on laimennettu peräkkäin 10- ja 100-kertaisesti. Resistenssin kriteerinä on tuberkuloosimykobakteerien visuaalisesti havaitun kasvun osuus. Ensilinjan lääkkeillä resistenssin kriteerinä on 1 %:n liiallinen kasvu alkuperäisestä populaatiosta, toisen linjan lääkkeillä - 1 %:n tai yli 10 %:n kasvu alkuperäisestä, valitusta kriittisestä pitoisuudesta riippuen.

Vuonna 1997 WHO:n ja Kansainvälisen tuberkuloosiliiton työryhmä, joka tutki tuberkuloosilääkeresistenssin havaitsemista, teki muutoksia näihin kriteereihin ja ehdotti, että tiheässä Lowenstein-Jensen-muna-alustassa kasvavia mykobakteereja pidetään resistentteinä seuraavilla pitoisuuksilla:

• dihydrostreptomysiini - 4 μg/ml;
• isoniatsidi - 0,2 µg/ml:
• rifampisiini - 40 mikrog/ml:
• Etambutoli - 2 mikrog/ml.

Vuonna 2001 ehdotettiin kriittisiä pitoisuuksia seuraaville toisen linjan lääkkeille (kriittiselle 1 prosentin osuudelle):

• kapreomysiini - 40 mikrog/ml;
• protionamidi - 40 mikrog/ml;
• kanamysiini - 30 μg/ml;
• viomysiini - 30 μg/ml;
• sikloseriini - 40 mikrog/ml;
• aminosalisyylihappo - 0,5 mikrog/ml;
• ofloksasiini - 2 mikrog/ml.

Kasvutulokset arvioidaan alustavasti neljän viikon kuluttua ja lopullisesti kuuden viikon viljelyn jälkeen.

Pyratsinamidin, jota käytetään laajalti nykyaikaisessa tuberkuloosikemoterapiassa, lääkeherkkyyden määrittämiseksi suositeltu kriittinen pitoisuus on 200 μg/ml. Yleisesti hyväksyttyä menetelmää lääkeresistenssin määrittämiseksi tälle lääkkeelle kiinteällä ravintoalustalla ei kuitenkaan ole, koska sen antibakteerinen aktiivisuus ilmenee vain happamassa ympäristössä (pH <6), jota on teknisesti vaikea ylläpitää. Lisäksi monet Mycobacterium tuberculosis -bakteerin kliiniset viljelmät eivät halua kasvaa munasoluissa happamassa ympäristössä.

Mykobakteerien lääkeherkkyyden määritystulosten laadun arvioimiseksi on suositeltavaa kontrolloida jokaista uutta Lowenstein-Jensen-elatusaine-erää rinnakkaismäärityksellä standardimuseokannan H37Rv herkkyys. Lisäksi on tiettyjä mikrobiologisia kriteerejä, jotka on täytettävä, jotta menetelmät antavat hyvin toistettavan ja oikein tulkittavan tuloksen. Näitä ovat tuberkuloosimykobakteeriviljelmän elinkyky, homogeenisen suspension ja lietteen saamista koskevat säännöt, tuberkuloosimykobakteeriviljelmien valintaa koskevat säännöt sekä valitun bakteerimassan edustavuus. Lääkeresistenssin määrittämisen luotettavuus heikkenee erittäin heikon bakteerien erityksen myötä.

Viime aikoina menetelmä lääkeherkkyyden määrittämiseksi automatisoitujen järjestelmien avulla on tunnustettu lupaavaksi. Tämän alan edistyneimpiä ovat VASTEC MGIT-960:een perustuvat kehitysaskeleet. Tässä tapauksessa tuberkuloosimykobakteerien lääkeherkkyys määritetään muunnetulla suhteutusmenetelmällä. Määrityksen aikana verrataan tuberkuloosimykobakteerien kasvunopeutta kontrolliputkessa ja lääkeputkissa. Streptomysiini-, isoniatsidi-, rifampisiini- ja etambutolherkkyyden määrittämiseksi käytetään SIRE-pakkaukseen sisältyviä rikastuslisäaineita ja antibiootteja. Pyratsinamidherkkyyden määrittämiseksi käytetään PZA-pakkausta. Testin aikana lääkeputkiin inokuloidaan tuberkuloosimykobakteerisuspensiota sekä kontrolliputkiin 100-kertaista laimennusta suspensiosta kaikille lääkkeille, lukuun ottamatta pyratsinamidia, jossa suspension laimennus on 10-kertainen. Stabiilisuuden kriteerinä on mykobakteerien kasvuindikaattori 100 GU, kun kasvu kontrolliputkessa saavuttaa 400 GU (katso "Viljelymenetelmät mykobakteerien eristämiseksi"). Tulokset tallennetaan ja tulkitaan automaattisesti, ja syötetty tai valittu ohjelma asettaa ne.

Kriittisinä pitoisuuksina käytetään koeputkessa nestemäisen ravintoalustan kanssa saatuja loppupitoisuuksia. Tällä hetkellä kriittisiä pitoisuuksia on kehitetty sekä ensilinjan lääkkeille että joillekin toisen linjan lääkkeille. On huomattava, että tuberkuloosimykobakteerien herkkyyden määritys sykloseriinille ja aminosalisyylihapolle suoritetaan vain kananmunien ravintoalustalla.

Yksityiskohtainen protokolla kuvatun järjestelmän kanssa työskentelyyn mahdollistaa lääkeherkkyystestauksen sekä eristetyllä viljelmällä (tiheällä ravintoalustalla) että käyttämällä mykobakteerien primaarikasvustoa MGIT-koeputkessa. Jälkimmäinen vaihtoehto lyhentää merkittävästi viljelytutkimusten suorittamiseen tarvittavaa aikaa, jolloin täydelliset tulokset tuberkuloosimykobakteerien viljelystä (mukaan lukien tiedot lääkeherkkyydestä) voidaan saada kolmen viikon kuluessa materiaalin keräämisestä, kun taas perinteinen menetelmä voi tarjota tämän vasta kolmannella kuukaudella. Oikea-aikaiset tulokset, kun potilas on intensiivisen hoidon vaiheessa, voivat kompensoida tutkimusten suhteellisen korkeita kustannuksia.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Mykobakteerien erilaistuminen

Koska käytetyt ravintoalustat eivät ole täysin selektiivisiä, eristettyjen mykobakteerien myöhempi erilaistaminen katsotaan välttämättömäksi. Mykobakteerien erilaistumisen tarve johtuu useista suvun edustajien aiheuttamien patologisten prosessien piirteistä: tuberkuloosin ja mykobakterioosin erilainen kulku ja lopputulos sekä luonnollinen lääkeresistenssi joillekin tuberkuloosilääkkeille.

On tunnustettua, että M. tuberculosis -kompleksin mykobakteerien ensisijainen tunnistaminen ei-tuberkuloosisista mykobakteereista suoritetaan seuraavien ominaisuuksien perusteella: kasvunopeus tiheässä ravintoalustassa, pigmentin muodostuminen, pesäkkeiden morfologia, happoresistenssin esiintyminen ja kasvulle optimaalinen lämpötila.

Valitettavasti ei ole olemassa yhtä laboratoriomenetelmää, joka pystyisi luotettavasti erottamaan M. tuberculosis -kompleksin mykobakteerit muista haponkestävistä mykobakteereista; edellä kuvattujen oireiden yhdistelmä useiden alla annettujen biokemiallisten testien tulosten kanssa mahdollistaa kuitenkin M. tuberculosis -kompleksin mykobakteerien tunnistamisen jopa 95 %:n todennäköisyydellä.

M. tuberculosis -kompleksin mykobakteerien (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii ja muut) erottamiseksi hitaasti kasvavista ei-tuberkuloosisista mykobakteereista käytetään perusbiokemiallisia testejä seuraavien oireiden havaitsemiseksi:

• kyky tuottaa nikotiinihappoa (niasiinitesti):
• nitraattireduktaasiaktiivisuus;
• termostabiili katalaasi;
• kasvatus natriumsalisylaattia (1 mg/ml) sisältävällä alustalla.

Lisätestinä voidaan käyttää myös kasvutestejä kasvatusalustalla, joka sisältää 500 μg/ml para-nitrobentsoehappoa tai 5 % natriumkloridia.

Monet bakteriologiset laboratoriot tunnistavat nämä mikro-organismit vain monimutkaisella tasolla, mikä johtuu laboratorioiden rajallisista kyvyistä ja asiantuntijoiden metodologisista kyvyistä.

Käytännössä useimmissa tapauksissa seuraavat testit riittävät M. tuberculosis - ja M. bovis -bakteerien erottamiseen toisistaan: niasiini, nitraattireduktaasi, pyratsinamidaasi ja kasvun rekisteröinti 2 μg/ml tiofeeni-2-karboksyylihappohydratsidia sisältävällä elatusaineella. Huomioidaan, että M. tuberculosis -kompleksin mykobakteereille on tunnusomaista seuraavat ominaisuudet:

• hidas kasvu (yli 3 viikkoa);
• kasvulämpötila 35–37 ^° C:ssa;
• pigmentaation puuttuminen (norsunluunvärinen);
• voimakas haponkestävä väri;
• positiivinen niasiinitesti;
• positiivinen nitraattireduktaasitesti;
• termostabiilin katalaasin puuttuminen (68 ^° C).
• kasvun puute Lowenstein-Jensen-elatusaineella, joka sisältää:
  • 1000 µg/ml natriumsalisyylihappoa,
  • 500 mikrog/ml para-nitrobentsoehappoa,
  • 5 % natriumkloridia:
• kasvua 1–5 μg/ml tiofeeni-2-karboksyylihapon läsnä ollessa.

Eristettyjen mykobakteerien erilaistumisen merkitys kasvaa merkittävästi tuberkuloosiin tai mykobakterioosiin liittyvien HIV/AIDS-tapausten rekisteröinnin yleistyessä. Tällä hetkellä ei ole täyttä varmuutta käytännön alueellisten laboratorioiden valmiudesta suorittaa tätä työmäärää oikein.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Tuberkuloosin immunologinen diagnostiikka

On olemassa useita yleismaailmallisia ilmiöitä, valmisteita ja immunologisia testejä, jotka alun perin löydettiin erityisesti tuberkuloosista tai mykobakteereihin kohdistuvan immuunivasteen mallista. Näitä ovat BCG ja tuberkuliini, kuten ihon DST (tuberkuliinitestit - Pirquet'n ja Mantoux'n reaktiot), reaktio tuberkuliinin ihonalaiseen antoon herkistetyillä eläimillä (Koch-ilmiö). Myös joitakin ensimmäisiä tartuntatautien vasta-aineita löydettiin tuberkuloosista. Mitä syvempi on ymmärrys tuberkuloosin vastaisen immuniteetin mekanismeista ja niiden geneettisestä kontrollista, sitä laajemmin immuniteettiin vaikuttavia immunologisia menetelmiä ja valmisteita voidaan käyttää fytisiologian käytännön ongelmien ratkaisemiseen.

Tärkeimpänä ja monimutkaisimpana käytännön ongelmana pidetään tällä hetkellä tuberkuloosin havaitsemista väestön massaseulonnassa. Huolimatta lukuisista "onnistumisraporteista" (rajoitetulla aineistolla), ei ole olemassa immunologista menetelmää (joka olisi toistettavissa "missä tahansa käsissä") tai lääkettä, joka sopisi näihin tarkoituksiin.

Immunologisia menetelmiä, erityisesti serologisia tutkimuksia (antigeenien, vasta-aineiden määritys) ja tuberkuliinin provokaatiotestejä, käytetään laajalti kliinisessä käytännössä.

Serologiset menetelmät, jotka määrittävät antigeenejä ja vasta-aineita kehon eri ympäristöissä, ovat ensimmäisellä sijalla erotusdiagnostiikassa käytettyjen immunologisten tutkimusten joukossa.

Mykobakteerien tuberkuloosia vastaan kohdistuvien vasta-aineiden määrityksen spesifisyys riippuu immuunianalyysissä käytetyistä antigeeneistä. Merkittävä määrä antigeenejä on ehdotettu, joista ensimmäinen on tuberkuliini PPD:

• PPD ja muut monimutkaiset valmisteet viljelynesteestä;
• ultraääninen hajotusaine;
• Triton-uute ja muut monimutkaiset soluseinävalmisteet;
• 5-antigeeni (Daniel);
• 60-antigeeni (Coccito);
• lipoarabinomannaani;
• napakalvotekijä (trehaloosi-6,6-dimykolaatti);
• fenoli- ja muut glykolipidit;
• lipopolysakkaridit;
• fibronektiiniä sitova antigeeni;
• proteiinit (useimmiten rekombinanttiproteiinit); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15, 12 KDA jne.

Venäläisten ja ulkomaisten tutkijoiden vuosien tutkimustyön tuloksena on tunnistettu vasta-aineiden muodostumisen pääasialliset mallit ja tuberkuloosin serologisen diagnostiikan tehokkuus: mitä monimutkaisempi antigeeni, sitä suurempi testien herkkyys ja alhaisempi spesifisyys. Spesifisyys vaihtelee eri maissa riippuen väestön M. tuberculosis- ja ei-tuberkuloottisten mykobakteerien infektiosta, BCG-rokotuksesta jne. Lapsilla serodiagnostiikan informatiivisuus on alhaisempi kuin aikuisilla. Primaarisessa tuberkuloosissa (useammin lapsilla) IgM:n määritys on informatiivisempi; sekundaarisessa tuberkuloosissa IgG:n määritys. HIV-tartunnan saaneilla henkilöillä serodiagnostiikan informatiivisuus vasta-aineiden määrittämisessä on heikentynyt. Vasta-aineiden määrityksen tehokkuus riippuu useista "kliinisistä tekijöistä": prosessin aktiivisuudesta (mykobakteerien "eristyksen" esiintymisestä tai puuttumisesta, mätänemisonteloiden esiintymisestä, infiltraation asteesta), prosessin esiintyvyydestä ja sen kulun kestosta.

Entsyymi-immunomäärityksen (EIA) herkkyys on noin 70 %. Tutkimuksen riittämätön tehokkuus johtuu sen alhaisesta spesifisyydestä. Aiemmin on harkittu serologisen seulonnan käyttömahdollisuuksia riskiryhmissä, erityisesti henkilöillä, joilla on tuberkuloosin jälkeisiä muutoksia keuhkoissa.

ELISA-menetelmän spesifisyyden lisäämiseksi etsitään spesifisempiä antigeenejä, mukaan lukien geenitekniikalla saatuja: ESAT-6 jne. (katso edellä). Tarkkaan spesifisten antigeenien (38 kDa, ESAT) käyttö lisää spesifisyyttä, mutta vähentää merkittävästi analyysin herkkyyttä. ELISA-menetelmän (kokeelliset laboratoriotestijärjestelmät, kuten Pathozyme ELISA -pakkaus) ohella tarjotaan myös lateraalisuodatuksella varustettuja immunokromatografisia pakkauksia (Mycodot) sekä muita vastaavia testejä (kalvopisteanalyysi), joissa testitulos arvioidaan visuaalisesti. Näitä testejä suoritettaessa analyysi kestää 10–30 minuuttia; ne eivät vaadi erityislaitteita, vaan tulosten visuaalista arviointia, johon liittyy tietty subjektiivisuus. Näillä menetelmillä on suunnilleen samat herkkyys- ja spesifisyysominaisuudet (70 % ja 90–93 %) kuin perinteisellä ELISA-menetelmällä.

Immuunianalyysimenetelmien käytöllä on tietty arvo lisämenetelmänä, joka otetaan huomioon tuberkuloosin erotusdiagnoosissa käytettyjen menetelmien kokonaisuudessa, erityisesti sen ekstrapulmonaalisten muotojen diagnosoinnissa. ELISA-menetelmä on tehokkain tuberkuloottisen meningiitin diagnosoinnissa aivo-selkäydinnestettä tutkittaessa. Tässä tapauksessa analyysin herkkyys on 80-85% ja spesifisyys 97-98%. On tietoa Mycobacterium tuberculosis -vasta-aineiden määrittämisen tehokkuudesta kyynelnesteessä tuberkuloottisen uveiitin diagnosoinnissa.

Gamma-interferonisynteesin induktio in vitro

Gammainterferoni (IFN-γ) on spesifisen immuunipuolustuksen tekijä, joka toteutuu aktivoimalla makrofagien entsyymijärjestelmiä. Herkistettyjen T-lymfosyyttien indusoima IFN-γ-synteesi johtuu niiden vuorovaikutuksesta mykobakteerien antigeenien kanssa.

Antigeeneinä käytetään sekä tuberkuliini PPD:tä että geenitekniikalla saatuja spesifisiä antigeenejä, erityisesti ESAT-6-antigeenia (varhainen erittyvä antigeeni, jonka molekyylipaino on 6 kDa) ja CFP-10:tä (viljelysuodosproteiini, 10 kDa). Geenitekniikalla tai rekombinanttiantigeenejä ei esiinny BCG-rokotteen ja muiden mykobakteerien soluissa. Tuberkuliinia käytettäessä IFN-γ-induktiotestin tulokset ovat verrattavissa tuberkuliinin ihotestin tuloksiin (suora korrelaatio). Geenitekniikalla valmistettuja antigeenejä käytettäessä testitulokset ovat spesifisempiä eivätkä riipu aiemmista BCG-rokotuksista. Tutkittaessa rokotettuja henkilöitä, jotka eivät ole olleet tekemisissä tuberkuloosi-infektion kanssa, testin spesifisyys on 99 %. Testin herkkyys tuberkuloosipotilailla vaihtelee 81–89 %:n välillä.

Testejä ja diagnostiikkaa on kehitetty lyhytaikaiseen kokoverisolujen tai verestä eristettyjen mononukleaaristen solujen viljelyyn tuberkuloosimykobakteerien antigeeneillä in vitro, minkä jälkeen määritetään IFN-γ-pitoisuus tai lasketaan IFN-γ:tä syntetisoivien T-lymfosyyttien lukumäärä. Koeputkessa syntetisoidun interferonin pitoisuus määritetään ELISA-menetelmällä käyttäen IFN-γ:tä sitovia monoklonaalisia vasta-aineita. Sitten määritetään standardi-IFN-γ:n kalibrointia käyttäen sen pitoisuus koeputkessa tai levyn kaivoissa.

Elispot-testissä lasketaan IFN-γ:tä syntetisoivien T-solujen lukumäärä IFN-γ-vasta-aineilla päällystetyn maljan pinnalta.

Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkeviraston (FDA) hyväksymän in vitro IFN-γ-induktiodiagnostiikan kehittäjät väittävät, että testi ei pysty erottamaan latenttia tuberkuloosi-infektiota aktiivisesta tuberkuloosista. Siksi testillä ei ole suoraa diagnostista arvoa alueilla, joilla on korkea infektioprosentti. Maassamme sitä voidaan kuitenkin käyttää lasten tuberkuloosi-infektion erottamiseen rokotuksen jälkeisestä allergiasta sekä spesifisen immuniteetin tason arvioimiseen hoidon aikana.

Tällä hetkellä tutkitaan kotimaista testijärjestelmää IFN-γ-synteesin induktion määrittämiseksi spesifisillä tuberkuloosiantigeeneillä in vitro.

Immuunitilanne ja tuberkuloosin kulku, immunokorjaus

Tuberkuloosin hoidon aikana ihmisillä esiintyy muutoksia antigeenien määrässä ja immuunijärjestelmän tilassa.

Tiedot eritteiden ja kudosten muutoksista ovat suurelta osin ristiriitaisia. Ainoa asia, joka voidaan täysin perustellusti todeta, on se, että tuberkuloottiset granulomat sisältävät yleensä merkittävän määrän aktivoituneita T-lymfosyyttejä.

On järkevää käsitellä vielä kahta seikkaa, jotka ovat välttämättömiä immunologisten mekanismien roolin ymmärtämiseksi tuberkuloosin hoidossa ihmisillä:

• AIDS-potilailla on erityisen korkea monilääkeresistenssin kehittymisen riski;
• Monilääkeresistenssin tapauksessa (ja ilman HIV-infektiota) immuunijärjestelmän häiriöt (pääasiassa T-soluimmuniteetti) ovat erityisen merkittäviä.

Tuberkuloosissa käytetään laajalti erilaisia immunokorrektiomenetelmiä: ensinnäkin nämä ovat lääkkeitä, jotka vaikuttavat pääasiassa T-solujen immuniteettiin ja mononukleaariseen fagosyyttijärjestelmään (kateenkorvan hormonit, isofoni, lykopidi, polyoksidonium jne.), sekä kokonaisiin (heikennetyihin) mykobakteereihin ja niiden komponentteihin.

Tuberkuloosin molekyylibiologinen diagnostiikka

Molekyylibiologiset menetelmät tartuntatautien diagnostiikassa sisältävät pääasiassa menetelmiä, jotka perustuvat bakteeri- ja viruspatogeenien genomisten materiaalien manipulointiin spesifisen geneettisen materiaalin - DNA-jaksojen, joilla on tietylle patogeenilajille tai -kannalle spesifinen nukleotidisekvenssi - tunnistamiseksi, spesifisten DNA-sekvenssien analysoimiseksi geeneissä, jotka määrittävät patogeenin herkkyyden tietyille lääkkeille, sekä patogeenin tiettyjen geenien toiminnallisen aktiivisuuden analysoimiseksi. Molekyylibiologiset menetelmät ovat yleistyneet tieteellisessä tutkimuksessa ja käytännön sovelluksissa erilaisten bakteeri- ja virusinfektioiden diagnostiikassa ja seurannassa sen jälkeen, kun Carrie Mullis (Nobel-palkinnon saaja, 1989) löysi polymeraasiketjureaktion vuonna 1985.

Polymeraasiketjureaktion periaatteet ja ominaisuudet

PCR mahdollistaa nukleotidisekvenssin (patogeeni-DNA:n fragmentin) monistamisen (kerrostamisen) koeputkessa muutamassa tunnissa miljoonia kertoja. Reaktion suorittaminen yksittäisten DNA-ketjujen läsnä ollessa määrittää analyysin poikkeuksellisen korkean herkkyyden.

DNA-ketjun tiettyjen osien nukleotidisekvenssi määrittää mikro-organismin geneettisen ainutlaatuisuuden, mikä selittää PCR:n korkean spesifisyyden.

Tämän menetelmän merkitys Mycobacterium tuberculosis -bakteerin ominaisuuksien havaitsemisessa ja tutkimisessa johtuu mikro-organismin biologisista ominaisuuksista, joilla on hyvin hidas kasvu: Mycobacterium tuberculosis -bakteerin DNA:n kaksinkertaistumisaika niiden viljelyn aikana on 12–24 tuntia.

PCR-menetelmän periaate on monistus - tietyn DNA-sekvenssin osien moninkertainen, miljoonien kertojen kertominen koeputken mikrovoluumissa seuraavien kolmen reaktiovaiheen syklisellä toistumisella, joista jokainen tapahtuu eri lämpötilatilassa:

• Vaihe I - kaksijuosteisen DNA:n denaturoituminen kuumennettaessa sen ketjujen hajaannuttua;
• Vaihe II - alukkeiden (pohjustavat oligonukleotidit) komplementaarinen sitoutuminen (hybridisaatio) tiukasti spesifisen DNA-fragmentin ketjujen päätyosiin, jotka on valittu monistusta varten;
• Vaihe III – DNA-fragmenttiketjun täydentäminen termostabiililla DNA-polymeraasilla.

Monistusprosessia varten koeputken on sisällettävä matriisi-DNA-molekyylejä. Neljää deoksinukleosiditrifosfaattityyppiä (nukleotideja), jotka sisältävät vastaavat typpipitoiset emäkset: adeniini (A), tymiini (T), guaniini (G), sytosiini (C); keinotekoisesti syntetisoituja 18-20 emäsparista koostuvia pohjustusoligonukleotideja (alukkeita); termostabiili entsyymi, DNA-polymeraasi, jonka lämpötilaoptimi on 68-72 ^° C, ja magnesiumioneja.

PCR:n spesifisyys riippuu DNA-fragmentin valinnasta. Sen mukaisesti syntetisoidaan vierekkäisiä alukeoligonukleotideja. Hybridisaation ja DNA-ketjun täydentymisen spesifisyys määräytyy seuraavien typpipitoisten emäsparien komplementaarisuuden periaatteen mukaan: adeniini-tymiini, guaniini-sytosiini.

Tuberkuloosikompleksimykobakteerien genomin määrittämiseksi tehokkain monistuskohde useimmissa testijärjestelmissä on IS6110-DNA-fragmentti, jolla on useimmissa tuberkuloosimykobakteerikannoissa merkittävä määrä (10–20) toistoa genomissa, mikä varmistaa spesifisyyden ohella analyysin korkean herkkyyden. Samalla on kuvattu tuberkuloosimykobakteerikantoja, joissa on pieni määrä toistoja tai IS6110-fragmentti puuttuu kokonaan.

DNA-molekyylien uuttaminen biologisesta näytteestä

PCR:n suorittamiseksi patogeenin DNA-molekyylit on eristettävä biologisesta materiaalista minimaalisessa tilavuudessa, minimaalisella määrällä epäspesifistä DNA:ta ja erilaisia entsyymin estäjiä - DNA-polymeraasi.

Näytteen valmistelu on suoritettava olosuhteissa, jotka estävät tutkittavien näytteiden ristikontaminaation eristetyillä DNA-molekyyleillä. Tämä edellyttää huoneen esikäsittelyä ultraviolettivalolla ja pöytien ja laitteiden lattioiden ja työtasojen käsittelyä klooria sisältävillä liuoksilla. On myös käytettävä puhtaita käsineitä, kertakäyttöisiä koeputkia ja automaattisten pipettien kärkiä.

Mycobacterium tuberculosis -bakteerin DNA:n eristämiseksi kliinisistä näytteistä (aivo-selkäydinneste, keuhkoputkien huuhtelu), jotka eivät sisällä suurta määrää leukosyyttejä, solujätteitä tai suoloja, riittää, että näyte sentrifugoidaan 3–4 tuhatta kierrosta minuutissa, lisätään sedimenttiin 20–30 µl 2-prosenttista Triton X-100 -liuosta ja kuumennetaan 90 ^° C:ssa 30 minuuttia.

Yskösnäytteen valmistus vaatii tehokasta nesteyttämistä, tyypillisesti käyttämällä 4 % natriumhydroksidia ja N-asetyyli-L-kysteiiniä (NALC) 50–80 mg näytettä kohden näytteen viskositeetista riippuen. NALC-liuos tulee valmistaa etukäteen tai NALC-jauhe voidaan lisätä kuivana suoraan näytteeseen. Nesteyttämisen jälkeen näytteitä tulee sentrifugoida 15 minuuttia nopeudella 3 500–4 000 rpm (3 000 g) 50 ml:n kierrekorkkiputkissa eli samoissa olosuhteissa, joita suositellaan ysköksen esiviljelylle.

DNA:n erottamiseksi sedimentistä käytetään useimmiten menetelmää, joka perustuu 5-6-molaarisen guanidiini-isotiosyanaattiliuoksen käyttöön lysointiaineena ja mikrohuokoisten piioksidihiukkasten ("piimaa") käyttöön, jotka sitovat DNA-molekyylejä. Epäspesifiset aineet, mukaan lukien mahdolliset inhibiittorit, pestään sitten 2,5-molaarisessa guanidiini-isotiosyanaattiliuoksessa ja etanoliliuoksessa, minkä jälkeen DNA-molekyylit desorboidaan veteen ja näitä näytteitä käytetään PCR:n suorittamiseen. DNA:n uuttamistekniikan yksinkertaistamiseksi "piimaa" korvataan usein piioksidilla päällystetyillä magneettisilla mikrohiukkasilla. Tässä tapauksessa hiukkasten saostamiseen käytetään sentrifugoinnin sijaan erityistä mikroputkille tarkoitettua magneettista jalustaa.

Venäjällä on kehitetty omaperäinen menetelmä mykobakteerien immunomagneettiseen erottamiseen, josta myöhemmin uutetaan patogeeni-DNA. Tuberkuloosimykobakteerien immunomagneettiseen erottamiseen käytetään piioksidilla päällystettyjä 3–5 μm:n kokoisia ferropartikkeleita, joihin tuberkuloosimykobakteereja vastaan kohdistuvat polyklonaaliset (kaniinin) vasta-aineet kiinnitetään kemiallisella sidoksella. Emäksisen lyysin jälkeen yskösnäytteet neutraloidaan happamalla Tris-HCl-liuoksella ja inkuboidaan immunomagneettisen sorbentin kanssa. Sitten immunoferropartikkelit kerätään vaihdettavalla kärjellä varustetulla magneettitangolla, siirretään mikroputkeen ja saostetaan. Lisätään 20–30 μl 2-prosenttista Triton X-100 -liuosta ja kuumennetaan 30 minuuttia 90 ^° C:ssa. Supernatanttia käytetään DNA-matriisina PCR-analyysissä.

Vaikea ongelma on tuberkuloosimykobakteerin DNA:n eristäminen biopsianäytteistä. Biopsianäytteiden lyysissä käytetään proteinaasi K -entsyymiä loppupitoisuudella 200–500 mg/l 56 ^° C:n lämpötilassa yön yli. Sen jälkeen se uutetaan jollakin tunnetuista menetelmistä. Liiallinen epäspesifinen DNA biopsianäytteiden PCR-analyysissä usein estää reaktion, mikä vaatii toistuvaa DNA:n uuttoa.

Tulosten havaitsemismenetelmät

Reaktion päätyttyä patogeeni-DNA:n monistetut fragmentit tunnistetaan erilaisilla menetelmillä.

Geelielektroforeesimenetelmä on hyvin tunnettu. Tässä tapauksessa saatu DNA-fragmentti tunnistetaan positiivisella kontrollilla, joka sisältää halutun spesifisen DNA-fragmentin, tai fragmentin aiemmin tunnetulla koolla (nukleotidiparien lukumäärällä), joka määritetään käyttämällä standardimolekyylimarkkeria.

Kaksijuosteiseen DNA:han sisältyvän spesifisen väriaineen - etidiumbromidin - läsnä ollessa syntetisoitu DNA-fragmentti paljastuu ultraviolettivalon vaikutuksesta hehkuvana nauhana.

DNA-fragmentin koon, joka määritetään elektroforeesilla alusta kuljetun matkan perusteella, on vastattava tunnettua molekyylipainomarkkeria tai positiivista kontrollia.

Muita PCR-tulosten määritysmenetelmiä ovat yksijuosteisten PCR-tuotteiden hybridisaatio komplementaarisen oligonukleotidin - biotiinilla leimatun DNA-koettimen - kanssa, minkä jälkeen havaitaan entsymaattisella reaktiolla esimerkiksi sitomalla streptavidiini-alkalinen fosfataasikonjugaatti biotiiniin.

Tämän tyyppisen havaitsemisen perusteella on kehitetty PCR-analysaattoreita, joissa PCR-tulosten havaitseminen tapahtuu automaattisesti lukemalla näytteiden optinen tiheys entsymaattisen reaktion tapahtumisen jälkeen.

Näiden menetelmien haittapuolena on laboratorion sisäisen kontaminaation mahdollisuus melko lyhyillä DNA-molekyylien fragmenteilla. Kun nämä molekyylit pääsevät juuri testattuihin näytteisiin, niistä tulee PCR-matriisi ja ne johtavat vääriin positiivisiin tuloksiin.

Tässä suhteessa väärien positiivisten tulosten estämiseksi on otettu käyttöön tiukat säännöt huoneiden erottamiseksi ja eristämiseksi: biologisten näytteiden DNA:n eristämiseen tarkoitetut huoneet ja tulosten havaitsemiseen (elektroforeesi) tarkoitetut huoneet puhtaasta vyöhykkeestä. Nämä huoneet edustavat todennäköisen kontaminaation vyöhykettä. Toinen eristetty vyöhyke on puhdas huone, johon tutkittavat DNA-näytteet viedään koeputkiin PCR-reaktioseoksen kanssa. Ja lopuksi oletetaan, että päälaite – DNA-vahvistin – on vietävä erilliseen, mahdollisesti toimistotilaan.

Aiempien reaktioiden tuotteiden - amplikonien - kontaminaation estämiseksi jotkut PCR-testijärjestelmät sisältävät deoksinukleosidiuridiinia deoksinukleosiditymidiinin sijaan. Tymidiini rakennetaan vastaavaan kohtaan in vitro -ketjusynteesin aikana. Eli natiivissa DNA:ssa oleva typpipitoinen tymiiniemäs korvataan urasiililla. Analysoidun materiaalin reaktioseokseen lisätty urasiili-DNA-glykosylaasi tuhoaa vain deoksiuridiinia sisältävät kontaminoivat fragmentit, mutta ei natiivia analysoitua, deoksitymidiiniä sisältävää DNA:ta. Seuraava kuumentaminen 94 ^° C:ssa inaktivoi tämän entsyymin eikä häiritse PCR:n monistusta.

On olemassa rRNA:n isotermiseen monistukseen perustuva testijärjestelmä, jossa ensin suoritetaan DNA-molekyylien käänteiskopiointi ja synteesi. Nämä molekyylit puolestaan toimivat matriisina RNA-molekyylien myöhemmälle synteesille. RNA-amplikonit havaitaan akridiinivärjätyllä DNA-koettimella hybridisaation aikana reaktioputkiliuoksessa. Tällä menetelmällä on korkean herkkyyden lisäksi etuna se, että analyysi suoritetaan yhdessä putkessa, mikä estää kontaminaation. Kirjoittajien mukaan menetelmän herkkyys hengitystienäytteissä saavuttaa 90 % ja spesifisyys 99–100 %.

Reaaliaikaisessa PCR:ssä otetaan käyttöön uusia havaitsemismenetelmiä. Nämä menetelmät eroavat pääasiassa siinä, että PCR ja sen tulosten havaitseminen suoritetaan samanaikaisesti yhdessä suljetussa koeputkessa. Tämä paitsi yksinkertaistaa teknologisesti analyysimenetelmää, myös estää laboratoriotilojen ja näytteiden kontaminaation aiempien PCR-menetelmien tuotteilla.

Reaaliaikaisessa PCR:ssä tulokset havaitaan fluoresenssin avulla, joka syntyy fluorogeenisen DNA-koettimen hybridisaatiosta spesifisen PCR:n aikana monistetun DNA-fragmentin kanssa. Fluorogeenisten DNA-koettimien rakenne on rakennettu siten, että fluoresoiva markkeri vapautuu entsymaattisen reaktion seurauksena tai etääntyy fluoresenssin sammuttajamolekyylistä vasta spesifisen hybridisaation jälkeen halutun PCR:n aikana monistetun DNA-molekyylin kanssa. Kun koettimen kanssa hybridisoituvien molekyylien määrä kasvaa, fluoresenssin kasvu havaittavalle tasolle on verrannollinen monistetun tuotteen molekyylien lukumäärään. Koska DNA-fragmenttimolekyylien määrä kaksinkertaistuu jokaisen PCR-syklin aikana, syklin numero, josta alkaen fluoresenssi havaitaan ja kasvaa, on kääntäen verrannollinen DNA-molekyylien lukumäärään alkuperäisessä näytteessä. Jos reaktioon lisätään useita eri tunnettuja pitoisuuksia vastaavan tuberkuloosimykobakteerin DNA-fragmentin molekyylejä kalibraattorina, tutkittavan materiaalin DNA-genomien lukumäärä voidaan laskea tietokoneohjelmalla.

Jokainen standardinäyte kahdennetaan. Määrällinen kriteeri on havaittavan fluoresenssin alkamiseen ja kasvuun tarvittavien PCR-syklien vähimmäismäärä. Abskissa-akseli on syklien lukumäärä; ordinaatta-akseli on fluoresenssiarvo. DNA-pitoisuudet ovat kääntäen verrannollisia fluoresenssin ilmaantumiseen tarvittavien syklien lukumäärään. Oikean sarakkeen ikkunat (21–32) näyttävät vastaavien pitoisuuksien syklinumerot. DNA-fragmenttien 10-kertaisten pitoisuuksien 10²–10³ ml välinen ero ^on 3,2–3,4 ^sykliä. Kahdella potilaalla IS6110-fragmenttien pitoisuudet olivat noin 10³ ^/ ml ja 10³ ^/ ml. Kun otetaan huomioon analysoitujen fragmenttien toistojen lukumäärät (6–20) Mycobacterium tuberculosis -bakteerin genomissa, Mycobacterium tuberculosis -bakteerin määrä kliinisissä näytteissä on noin 100 ja 1000 solua.

PCR:n käyttö tuberkuloosin diagnosoinnissa

PCR-menetelmää käytetään laajimmin tuberkuloosin nopeaan diagnosointiin – Mycobacterium tuberculosis -bakteerin havaitsemiseen kliinisistä näytteistä: ysköksestä, keuhkoputkien huuhtelunesteestä, pleuraeritteestä, virtsasta, aivo-selkäydinnesteestä, osteolyysipunktioista, naisen sukupuolielinten aspiraateista ja erilaisista biopsioista. Hollannissa tehdyssä tutkimuksessa, jossa käsiteltiin noin 500 yskös- ja keuhkoputkien huuhtelunäytettä 340 potilaalta, joilla oli vahvistettu keuhkotuberkuloosidiagnoosi, vertailtiin PCR-, viljely- ja sivelymikroskopiamenetelmien herkkyyttä. Analyysin herkkyys oli 92,6 %, 88,9 % ja 52,4 %. Kaikkien menetelmien spesifisyys oli noin 99 %.

Mycobacterium tuberculosis -bakteerin havaitsemisen tehokkuutta verrattiin käyttämällä sivelymikroskopiaa, kylvöä Lowenstein-Jensen-elatusaineelle, VASTES-testijärjestelmää ja PCR-analyysiä. PCR:n herkkyys oli 74,4 %, mikroskopian herkkyys 33,8 %, kylvö kiinteälle elatusaineelle 48,9 % ja VASTESin herkkyys 55,8 %. Keskimääräinen havaitsemisaika Lowenstein-Jensen-elatusaineelle kylvämisessä on 24 päivää, VASTESissa 13 päivää ja PCRissa 1 päivä.

Myös PCR:n käyttömahdollisuuksia herkkänä ja nopeana menetelmänä tuberkuloosihoidon tehokkuuden seurantaan käsitellään.

Mycobacterium tuberculosis -DNA:n havaitseminen PCR-menetelmällä tehokkaalla kemoterapialla määritetään pidemmän ajan kuluessa - keskimäärin 1,7 kuukautta verrattuna fluoresenssimikroskopialla määritettyyn bakteerien erittymiseen ja 2,5 kuukautta verrattuna bakteriologiseen tutkimukseen.

Tuberkuloosin ekstrapulmonaalisten muotojen diagnosointi

PCR:n merkitys herkkänä menetelmänä on erityisen suuri keuhkojen ulkopuolisissa muodoissa, koska juuri näissä muodoissa kliiniset ja radiologiset menetelmät sekä perinteiset bakteriologiset menetelmät Mycobacterium tuberculosis -bakteerin määrittämiseksi diagnostisissa materiaaleissa ovat tehottomia.

Virtsanäytteitä tutkittaessa PCR-analyysin tulokset olivat positiivisia 16:lla 17:stä aktiivista virtsateiden tuberkuloosia sairastavasta potilaasta ja negatiivisia neljällä inaktiivista munuaistuberkuloosia sairastavalla potilaalla ja 39:llä ei-tuberkuloottista virtsateiden sairausta sairastavalla potilaalla.

PCR-analyysin tehokkuutta osoitettiin luuydinaspiraattien tutkimuksessa potilailla, joilla oli tuntemattoman alkuperän kuume ja epäilty taudin tuberkuloosiluonne. Lasten tuberkuloottisen lymfadeniitin diagnosoimiseksi tutkittiin 102 punktioaspiraattia ja koepalaa 67 lapselta, joilla epäiltiin tuberkuloottista lymfadeniittia. Positiivisia tuloksia saatiin: reaaliaikaisessa PCR:ssä - 71,6 %, fluoresenssimikroskopiassa - 46,3 % ja viljelytutkimuksessa - 41,8 %. Kissanraaputustautia sairastavien potilaiden 50 imusolmukebiopsian tutkimuksessa kaikki tulokset olivat negatiivisia. Näin ollen PCR-analyysin spesifisyys oli 100 %. Samassa työssä osoitettiin mahdollisuus havaita M. avium imusolmukkeiden punktiobiopsiassa.

Naisten sukupuolielinten tuberkuloosin diagnosointi lapsettomuudessa tiedetään olevan yksi vaikeimmista diagnostisista ongelmista. Positiivisia tuloksia saatiin endometriumin biopsioiden, endometriumin aspiraattien ja Douglas-pussinestenäytteiden PCR-tutkimuksissa 14:llä (56 %) 25:stä laparoskooppisesti tutkitusta potilaasta, joilla epäiltiin tuberkuloosia. Sivelymikroskopia ja viljelytutkimukset antoivat 1 ja 2 positiivista tulosta. Nämä tapaukset olivat myös PCR-positiivisia. Useimmat PCR-positiiviset tulokset saatiin tapauksissa, joissa histologisessa tutkimuksessa oli tuberkuloosin tyypillisiä piirteitä; pienempi osa oli tapauksissa, joissa laparoskopian perusteella epäiltiin tuberkuloosia. Vain yksi positiivinen PCR-tulos saatiin ilman laparoskooppisia tuberkuloositietoja.

Tuberkuloosin ekstrapulmonaalisten muotojen diagnosoinnissa lääkäreillä on usein kysymys taudinaiheuttajan tunnistamisen mahdollisuudesta tutkittaessa verinäytteitä PCR-menetelmällä. Kirjallisuustiedot osoittavat, että Mycobacterium tuberculosis -DNA:n havaitseminen verinäytteistä on mahdollista HIV-infektion pitkälle edenneissä muodoissa. Mycobacterium tuberculosis -DNA:ta havaittiin vain yleistyneessä eri elinten tuberkuloosissa potilailla, joilla oli siirretty munuainen ja immuunipuutos.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Mykobakteerien lajien tunnistaminen

PCR-menetelmä voi olla varsin tehokas tuberkuloosikompleksin mykobakteerien ja joidenkin ei-tuberkuloottisten mykobakteerityyppien nopeaan tunnistamiseen niiden primaarisen kasvun jälkeen. Tässä tapauksessa PCR:n käyttö voi säästää 7–10 päivää, jotka tarvitaan positiivisen tuloksen myöhempään viljelytunnistukseen. PCR-tutkimus on teknisesti hyvin yksinkertainen, koska se ei vaadi monimutkaista kliinisen materiaalin näytteenvalmistusta korkean herkkyyden saavuttamiseksi. Tutkittaessa 80 positiivista viljelmää tällaisessa testijärjestelmässä (MB BacT. by Organon), kaikki positiiviset PCR-analyysitulokset olivat ehdottoman spesifisiä ja suoritettiin yhden päivän kuluessa. Muiden mykobakteerityyppien tunnistamiseksi viljelmästä saatujen bakteerien DNA hybridisoidaan spesifisten, akridiinilla leimattujen DNA-koettimien kanssa, ja kannat havaitaan kemiluminesenssin perusteella kemiluminesenssin avulla kemiluminesenssin avulla tai nitroselluloosaliuskoilla visuaalisella arvioinnilla hybridisaation jälkeen. Tämä pakkaus tunnistaa rajoitetun määrän lajeja: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii ja M. gordonae.

A. Telenti ym. kehittivät myös suhteellisen yksinkertaisen ja edullisen menetelmän kliinisesti tärkeiden mykobakteerien lajien tunnistamiseksi PCR:n ja sitä seuraavan kahden restriktioentsyymin (entsyymit, joilla on kyky leikata DNA-molekyyli tietyistä kohdista) käsittelyn perusteella. Tässä tapauksessa monistetaan lämpöshokkiproteiinia (65 kDa) koodaava DNA-fragmentti, jonka jälkeen PCR:ssä saatu 439 nukleotidiparin kokoinen DNA-fragmentti käsitellään erikseen kahdella entsyymillä - Bste II ja Nae III. Sitten analysoidaan kaksi saatua tuotetta agaroosigeelielektroforeesilla ja määritetään niiden koot (nukleotidiparien lukumäärä) käyttämällä joukkoa standardi-DNA-fragmentteja (molekyyli-DNA-markkereita), joiden pituus on 100 - 1000 nukleotidiparia. Jokaisesta määritellystä lajista (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. fortuitum) löytyy 2 tai 3 erikokoista DNA-fragmenttia kutakin restriktioentsyymiä kohden. Tuloksena olevien erikokoisten DNA-fragmenttien yhdistelmä mahdollistaa näiden lajien erottamisen toisistaan.

Biologisten DNA-mikrosirujen teknologiaa kehitetään parhaillaan, ja sen avulla voidaan tunnistaa yli 100 mykobakteerilajia yhdessä tutkimuksessa.

Lajitunnistus voidaan suorittaa myös käyttämällä 16S rRNA:n vaihtelevan alueen PCR-monistusta, jota seuraa amplikonien sekvensointi verrattuna vastaavaan primaarirakenteeseen, mikä mahdollistaa yli 40 mykobakteerilajin tunnistamisen.

PCR:ää voidaan käyttää myös lajien tunnistamiseen tuberkuloosi-mykobakteerikompleksissa, mukaan lukien M. bovisin ja M. bovis BCG:n erottaminen toisistaan. Tämä tehdään analysoimalla tiettyjen geenien esiintymistä tai puuttumista genomialueilla RD1, RD9 ja RD10. RD1 puuttuu M. bovis BCG:stä, mutta sitä esiintyy virulenteissa lajeissa, mukaan lukien M. bovis.

Mycobacterium tuberculosis -bakteerin lääkeherkkyyden määrittäminen PCR-menetelmällä

Molekyyligeneettisten menetelmien tehtävät Mycobacterium tuberculosis -bakteerin lääkeherkkyyden tai resistenssin määrittämiseksi rajoittuvat tunnettujen geenien tiettyjen nukleotidisekvenssien mutaatioiden tunnistamiseen. Päämenetelmät perustuvat joko näiden sekvenssien suoraan lukemiseen (sekvensointiin) monistuksen jälkeen tai PCR:n aikana monistettujen biotiinilla merkittyjen DNA-fragmenttien hybridisaatioon DNA-koettimilla. Molemmat vaihtoehdot edellyttävät sellaisten nukleotidisekvenssien substituutioiden tunnistamista, jotka DNA-koettimia käytettäessä johtavat hybridisaation puuttumiseen tai epätäydelliseen toteutumiseen nitroselluloosakalvolla entsyymikonjugaatilla (streptavidiini-alkalinen fosfataasi) - LIPA-Rif-TB-menetelmällä.

Menetelmää, jolla mitataan paikallisesti kiinnitettyjen DNA-koettimien fluoresenssia mikroalueilla, jotka ovat komplementaarisia PCR-monistettujen geenialueiden tunnettujen mutaatioiden kanssa, jotka ovat vastuussa lääkeherkkyydestä tai -resistenssistä, kutsutaan mikrobisirumenetelmäksi. Tämän tutkimuksen perusalgoritmi on seuraava. Kun DNA on eristetty kliinisestä näytteestä tai mykobakteeriviljelmästä, on suoritettava PCR monistamaan vastaavat groB-geenin fragmentit, jotka ovat vastuussa lääkeherkkyydestä rifampisiinille, tai katG- ja inhA-geenit, jotka koodaavat mykobakteeriproteiineja, jotka ovat vastuussa herkkyydestä isoniatsidille. PCR-tulokset arvioidaan agaroosigeelielektroforeesilla, joka varmistaa halutun pituisten vastaavien DNA-fragmenttien vastaanottamisen. Sitten suoritetaan toinen PCR-kierros fluoresoivan leiman lisäämiseksi DNA:han. PCR-tulokset vahvistetaan jälleen geelielektroforeesilla. Tämän jälkeen suoritetaan hybridisaatio (inkubointi yön yli) ja saatu materiaali pestään sen jälkeen biosirulla, joka on suuri määrä lyhyitä DNA-ketjuja (koettimia), jotka on kiinnitetty pienelle lasilevylle ja jotka ovat komplementaarisia lääkeherkän tuberkuloosimykobakteerityypin nukleotidisekvensseille mahdollisten mutaatioiden kohdissa. sekä lääkeresistenssistä vastaaviin mutanttisekvensseihin. DNA-koettimien sijainti levyllä on tarkasti määritelty, ja hybridisaation aikana havaittu fluoresenssin taso tulosten määrittämiseksi erityisellä lukulaitteella vahvistetaan. Tässä suhteessa analyysin tulokset määritetään erityisellä tietokoneohjelmalla.

Viime vuosina on kehitetty vaihtoehtoisia menetelmiä Mycobacterium tuberculosis -bakteerin lääkeherkkyyden määrittämiseksi reaaliaikaisen PCR-tekniikan avulla, mikä mahdollistaa näiden tutkimusten suorittamisen suljetussa koeputkitilassa.

Kuva 13-13 esittää Mycobacterium tuberculosis -bakteerin kliinisten viljelmien analyysin tulokset rifampisiiniresistenssin määrittämiseksi reaaliaikaisella PCR:llä: 218 - kontrollinäyte (herkkä rifampisiinille); 93 - positiivinen kontrolli Ser-Trp TCG-TGG-mutaatiolle; 4482 - positiivinen kontrolli Ser-Leu TCG-TTG-mutaatiolle; 162-322 - kokeelliset näytteet. Neljän kanavan monistuskineettisten käyrien laskennan tulos: kanava 1: 393 - positiivinen kontrolli Ser-Trp TCG-TGG-mutaatiolle; kanava 2: 4482 - positiivinen kontrolli Ser-Leu TCG-TTG-mutaatiolle; 162, 163, 172, 295 - kokeelliset näytteet; kanava 4: kaikkien kokeeseen osallistuvien näytteiden monistuskineettiset käyrät. Monistusreaktion positiivinen kontrolli. Johtopäätökset: Analyysi paljasti seuraavat rifampisiiniresistenssin aiheuttavat mutaatiot: näytteissä 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Samaa periaatetta käytettiin isoniatsidiresistenssin määrittämiseen katG- ja inhA-geenien avulla, jotka määräävät yleisimmät mutaatiot.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Mycobacterium tuberculosis -kannan tunnistaminen

Tutkituin menetelmä Mycobacterium tuberculosis -kantojen tunnistamiseksi on tekniikka, jota kutsutaan restriktiofragmenttien pituuspolymorfismiksi (RFLP), ja se perustuu Mycobacterium tuberculosis -DNA:n fragmentointiin (restriktioon) Pvu II -entsyymillä ja saatujen fragmenttien myöhempään hybridisaatioon tiettyjen spesifisten sekvenssien kanssa sen toistoelementin IS6110 DNA:ssa. Lajinsisäinen vaihtelu toteutuu IS6110-toistojen eri lukumäärän ja niiden sijainnin DNA:ssa sekä restriktioentsyymin tiettyjen hyökkäyspisteiden (restriktiokohtien) ja IS6110-elementin välisten etäisyyksien vaihtelun vuoksi. Tämä tekniikka on erittäin monimutkainen ja työvoimavaltainen. Kun tuberkuloosimykobakteeriviljelmästä eristetty DNA on käsitelty restriktioentsyymillä, suoritetaan geelielektroforeesi, jonka jälkeen eripituiset DNA-fragmentit siirretään nitroselluloosakalvolle, hybridisoidaan IS6110-elementin fragmenttien kanssa ja tulokset havaitaan entsymaattisella reaktiolla. Tuloksena oleva spesifinen juovikuvio karakterisoi tietyn tuberkuloosimykobakteerikannan DNA:n. Tietokoneanalyysi paljastaa kantojen identiteetin tai sukulaisuuden. Vaikka RFLP-menetelmä onkin erottelevin eli se paljastaa eniten eroja analysoiduissa kannoissa, se on tehoton pienellä määrällä (alle 5) IS6110-toistoja, joita havaitaan joissakin kannoissa. Kuviot 13–14 esittävät kantojen RFLP-tyypityksen tuloksia.

Vaihtoehtona voi olla spoligotyypitysmenetelmä – DR-alueen suorien toistojen välissä olevien välisekvenssien polymorfismin analyysi. Kantojen spoligotyypitystä suoritettaessa PCR suoritetaan DR-aluetta rajoittavilla alukkeilla, minkä jälkeen muodostuu eri pituisia fragmentteja, jotka hybridisoituvat vaihtelevien DNA-välialueiden kanssa. DR-alueen välisekvenssien analyysi näyttää tutkijoiden mukaan yksinkertaisemmalta, tuottavammalta ja sopivammalta kantojen primaariseulontaan ja alustavaan epidemiologiseen analyysiin sekä kliinisen materiaalin suoraan tutkimiseen.

Tehokkaampi ja teknisesti helpommin saavutettava menetelmä on luonnollisesti VNTR (lyhenne englanninkielisistä sanoista) eli menetelmä, jolla määritetään tarkkojen tandemtoistojen vaihteleva määrä Mycobacterium tuberculosis -bakteerin DNA:ssa. Tämä menetelmä perustuu yksinomaan PCR:n käyttöön eikä vaadi lisäkäsittelyjä. Koska tandemtoistojen määrä eri kannoissa ja eri lokuksissa on erilainen, eri kokoisia fragmentteja määritetään ja analysoidaan PCR-tuotteiden elektroforeesilla. Tutkijoiden mukaan VNTR:n avulla saavutetaan parempi kantojen erottelukyky kuin RFLP-menetelmällä.

Viime vuosina on kiinnitetty paljon huomiota W-Beijing-heimon Mycobacterium tuberculosis -kantojen (joita joskus kutsutaan myös Pekingin kannaksi) leviämiseen, sillä ne ovat pääosin lääkeresistenttejä.

Molekyylibiologisen tutkimuksen laadun perusvaatimukset

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Tärkeimmät PCR:n suorittamista koskevat sääntelyasiakirjat

Venäjän federaation terveysministeriön määräykset: nro 45, 7.2.2000; nro 109, 21.3.2003; nro 64, 21.2.2000. Ohjeet: 1.3.1888-04 "Työn organisointi III-IV patogeenisuusryhmien patogeenisilla biologisilla aineilla infektoidun materiaalin PCR-tutkimuksessa"; 1.3.1794-03 "Työn organisointi I-II patogeenisuusryhmien mikro-organismeilla infektoidun materiaalin PCR-tutkimuksessa". 2003; 3.5.5.1034-01 "Patogeenisuusryhmien I-IV bakteereilla infektoidun testimateriaalin desinfiointi PCR-menetelmällä työskenneltäessä", 2001. Liite 11 ohjeisiin tuberkuloosin havaitsemisessa, diagnosoinnissa ja hoidossa käytettävistä mikrobiologisista tutkimusmenetelmistä.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Henkilökunta

Molekyylibiologisia tutkimuksia voivat suorittaa kliinisen laboratoriodiagnostiikan lääkärit, bakteriologit, virologit, kliinisen diagnostiikan laboratoriobiologit sekä keskiasteen lääketieteellisen koulutuksen saaneet asiantuntijat, jotka ovat erikoistuneet ja täydentäneet koulutustaan vakiintuneella tavalla.

Laboratoriotilojen järjestely

Seuraavat laboratoriolaitteet vaaditaan:

• Näytteenkäsittelyalue - patogeenisuusryhmien III-IV tartuntatautien aiheuttajien kanssa työskentelyyn mukautettu laboratorio menetelmäohjeiden 13.1888-04 mukaisesti.
• PCR-reaktioseosten valmistusalue on laboratoriohuone, joka suojaa laboratorion sisäiseltä kontaminaatiolta – ”puhdas” alue.
• • Jos PCR-tuotteiden analysointiin käytetään elektroforeesia tai hybridisaatiota, laboratoriotilan, jossa monistetut DNA-fragmentit uutetaan monistusputkesta ja jotka näin ollen voivat päästä ympäristöön, on PCR-laboratorioille asetettujen vaatimusten (menetelmäohjeet 1.3.1794-03, menetelmäohjeet 1.3.1888-04) mukaisesti oltava täysin eristetty edellisissä kappaleissa mainituista tiloista. Henkilöstön, laitteiden, materiaalien ja esineiden liikkuminen elektroforeesialueelta näytteenkäsittelyalueelle ja "puhtaalle" alueelle sekä ilman siirtyminen ilmanvaihtojärjestelmän kautta tai vedon seurauksena on estettävä. Tätä aluetta ei vaadita PCR-tuotteiden fluorimetriseen havaitsemiseen.
• Tulosten dokumentointiin ja käsittelyyn tarkoitettu huone on varustettu tietokoneilla ja tarvittavilla toimistolaitteilla. Tässä huoneessa voi olla laitteita, jotka varmistavat PCR-tuotteiden havaitsemisen avaamatta putkea. - fluoresoivia PCR-detektoreita ja lämpösyklereitä reaaliaikaista PCR:ää varten.

Ysköksen ensisijaisen käsittelyn terveys- ja epidemiologiset vaatimukset ovat samanlaiset kuin Mycobacterium tuberculosis -bakteerin kanssa työskentelyn mikrobiologiset standardivaatimukset.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Täydellinen laboratoriolaitteisto PCR-diagnostiikkaan

Laboratoriopakkaus sisältää laitteet seuraaviin huoneisiin.

• näytteenvalmistushuone, sisältää seuraavat laitteet: suojausluokan II "SP-1.2" laminaarivirtauskupu: kiinteän olomuodon termostaatti lämmitettävällä kannella Eppendorf-koeputkille; mikrosentrifugi 13 000 rpm; sentrifugi ("Vortex"); jääkaappi, jonka lämpötila-alue on -20 ^° C - +10 ^° C; "Proline"-sarjan muuttuvan tilavuuden pipettejä; pumppu OM-1-loukulla; pipettiteline; työasemateline 200 x 0,5 ml; työasemateline 50 x 1,5 ml; telineet koeputkien säilyttämiseen 80 x 1,5 ml;
• reaktioseoksen valmistushuone: suojakammio PCR-laatikko ("Laminar-C. 110 cm"); sentrifugi "Vortex"; "Proline"-sarjan muuttuvan tilavuuden pipettejä; pipettiteline; työasemateline 200x0,2 ml; telineet koeputkien säilyttämiseen 80x1,5 ml; jääkaappi, jonka lämpötila-alue on -20 ^° C - +10 ^° C;
• Elektroforeesihuone: vaakasuora elektroforeesikammio; virtalähde; läpivalaisin;
• DNA-vahvistin tai nukleiinihappoanalysaattori (reaaliaikainen PCR) tietokoneella ja ohjelmistolla; voidaan sijoittaa mihin tahansa käytettävissä olevaan huoneeseen. Jos käytetään reaaliaikaista PCR-tekniikkaa, elektroforeesihuonetta ei tarvita.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Ulkoinen laadunvalvonta

Jotta laboratoriot saisivat objektiivisesti luotettavia tuloksia, niiden on osallistuttava laboratoriotutkimuksen laadun ulkoiseen arviointijärjestelmään.

Laadunvalvontajärjestelmään osallistuvat saavat: 12 ampullia, joissa on kylmäkuivattuja bakteerisolususpensioita, joista kaksi sisältää E. colia, 3 ampullia, joissa on tuberkuloosimykobakteereja (avirulentti kanta) pitoisuutena 102 ^/ ml; 3 ampullia, joissa on samanlaisen kannan soluja pitoisuutena 104 ^/ ml; 2 ampullia, joissa on kutakin ei-tuberkuloosisia mykobakteereja M. avium-intracellulare ja M. kansasii, pitoisuutena 105 ^/ ml.

Ulkoiseen laadunarviointiin lähetetyt testit testataan etukäteen kahdessa riippumattomassa laboratoriossa, joilla on laaja kokemus tällä alalla.

[ 85 ], [ 86 ]