Ei-viraalinen geeniterapia tarjoaa toivoa krooniseen alaselkäkipuun

Biomaterials-lehdessä julkaistussa äskettäisessä tutkimuksessa tutkijat kehittivät uudenlaisen ei-viraalisen geeniterapian diskogeenisen selkäkivun (DBP) hoitoon toimittamalla transkriptiotekijä Forkhead Box F1 (FOXF1) -geenin degeneratiivisiin nikamien välilevyihin (IVD) in vivo -olosuhteissa käyttäen muokattuja solunulkoisia vesikkeleitä (eEV).

Krooninen alaselkäkipu on kasvava maailmanlaajuinen ongelma ikääntyvän väestön ja pahenevien opioidiongelmien vuoksi. Nykyisiin hoitoihin kuuluvat lyhytaikainen helpotus tai kalliit leikkaukset, mikä korostaa riippuvuutta aiheuttamattomien ja vähemmän invasiivisten hoitojen tarvetta.

Nykyiset biologiset lähestymistavat, kuten kasvutekijöiden anto, soluterapia ja virusgeeniterapia, voivat vähentää rappeutumista eläin- ja ihmismalleissa. Lyhytaikaiset vaikutukset, heikko pitkäaikainen teho sekä tarpeeton immunogeenisuus ja onkogeenisuus voivat kuitenkin haitata näiden lähestymistapojen suoraa soveltamista.

Tässä tutkimuksessa tutkijat kehittivät viruksettoman geeniterapian nikamien välisen levyn rappeutumiseen (IVD) käyttämällä FOXF1-eEV:tä.

Tutkijat transfektoivat hiiren alkion primaarisia fibroblasteja (PMEF) plasmideilla, jotka sisälsivät kontrollina FOXF1:tä tai pCMV6:ta, ja karakterisoivat eEV-näytteitä nanopartikkelien seurantamäärityksellä (NTA).

He arvioivat molekyylirahdin tehokasta lastaamista eEV-soluihin käyttämällä kvantitatiivista käänteiskopiointi-polymeraasiketjureaktiota (qRT-PCR) ja tavanomaista PCR:ää. Western blot -analyysi tunnisti FOXF1- ja EV-spesifisiä proteiineja eEV-muodostelmissa. Tiimi käytti plasmideja, jotka tehostavat ylempiä ja alempia polylinkkerialueita, määrittääkseen FOXF1-plasmidi-DNA:n läsnäolon luovuttajasoluissa ja loi eEV-soluja.

He tutkivat plasmidi-DNA:sta tuotettua täyspitkää mRNA:ta eEV-soluissa ja luovuttajasoluissa.

Tutkijat loivat transkriptiotekijöillä solunulkoisia vesikkeleitä kudosten toiminnan palauttamiseksi ja kipuvasteiden muuttamiseksi DBP:n eläinmallissa.

He tunnistivat elektronivariantteja FOXF1:n kuljetukseen ja jakautumiseen vaurioituneisiin nikamien välisiin välilevyihin hiirimallissa, jossa käytettiin diskogeenista selkäkipua, määrittääkseen FOXF1 eEV:n vaikutuksen nikamien välisen välilevyn rappeutumisen estämiseen.

Tiimi yhdisti hiiren nikamien välilevyjen biomekaanisen testauksen kuvantamiseen, solunulkoisen matriisin (ECM) muutoksiin ja 12 viikon kuluttua arvioituihin kipuvasteisiin varmistaakseen terapeuttisen intervention aiheuttamat rakenteen ja toiminnan muutokset sekä kivun.

Leikkausta edeltäviin ja sen jälkeisiin kivunarviointeihin sisältyivät mikrotietokonetomografia (mikro-TT), magneettikuvaus (MRI), mekaaninen testaus, Alcian-sininen (AB) ja pikrosiriuspunainen (PSR) -värjäys, dimetyylimetyleenisinitesti ja immunohistokemia (IHC).

Tutkimuksessa käytettiin kirurgista tekniikkaa, jossa tutkijat antoivat hiirille ihon alle buprenorfiinia ER:ää leikkauksen jälkeisen kivun hallitsemiseksi.

Tiimi suoritti käyttäytymisarviointeja ennen leikkausta ja kahden viikon välein neljästä kahteentoista viikkoon leikkauksen jälkeen käyttäen erilaisia menetelmiä, kuten avokenttätestiä, kylmälevytestiä, häntäripustusta ja lankaripustusta.

Avokenttätestissä arvioitiin hiirten spontaania aktiivisuutta; kylmälevytesteissä mitattiin termistä hyperalgesiaa; hännänripustustesteissä mitattiin aksiaalista kipua; ja lankaripustustesteissä mitattiin voimaa.

Kaksitoista viikkoa leikkauksen jälkeen tiimi dissektoi eläinten lannerangat reisiluun hermo- ja valtimojäljitystä käyttäen nikamavälilevyjen tunnistamiseksi nikamien L4 ja L5, L5 ja L6 sekä L6 ja S1 IVD:n välillä. He käyttivät L5/L6 IVD:tä histologian arviointiin ja glykosaminoglykaanipitoisuuden (GAG) määrittämiseen.

FOXF1-eEV:t vähensivät merkittävästi kipuvasteita samalla kun ne palauttivat IVD:n rakenteen ja toiminnan, mukaan lukien parantuneet välilevyn korkeudet, kudosten nesteytys, proteoglykaanipitoisuus ja mekaaniset ominaisuudet.

Tutkimus keskittyi FOXF1:tä sisältävien eEV-solujen vapautumiseen transkriptiotekijä FOXF1:llä transfektoiduista primaarisista fibroblasteista. Kvantitatiivinen RT PCR osoitti merkittävää nousua FOXF1-mRNA-transkriptipitoisuuksissa ja täysimittaisten transkriptoitujen FOXF1-mRNA-tasoissa verrattuna pCMV6-transfektoituihin soluihin.

FOXF1 eEV -hoito voi vähentää kipureaktioita lannevälilevyn punktiomallissa hiirillä jopa 12 viikon ajan. Naarashiirillä havaittiin pidempiä kohtausaikoja FOXF1-hoitoa saaneessa ryhmässä kuin loukkaantuneessa ryhmässä, ja nämä ajat kestivät vähintään 12 viikkoa hoidon jälkeen.

FOXF1 eEV -hoito paransi IVD-kudoksen nesteytystä ja pituutta loukkaantuneilla ja degeneratiivisilla eläimillä in vivo samalla säilyttäen nesteytystasot ja IVD-levyn T2-painotetun kuvantamisintensiteetin.

Tutkimusryhmä havaitsi kuitenkin välilevyn korkeuden pienenemistä loukkaantuneilla eläimillä ja pCMV6 eEV:llä hoidetuilla eläimillä. FOXF1 eEV:llä hoidetuilla hiirillä ei havaittu välilevyn korkeuden pienenemistä 12 viikkoa hoidon jälkeen. Sukupuolella ei ollut vaikutusta toiminnallisiin tuloksiin.

FOXF1 eEV:t palauttivat vaurioituneiden ja rappeutuneiden IVD:iden mekaanisen toiminnan in vivo. Aksiaalisen rasituksen alaisena FOXF1 eEV:illä käsitellyt IVD:t osoittivat suurempaa normalisoitua NZ-jäykkyyttä verrattuna vaurioituneisiin IVD:ihin.

Virumisolosuhteissa vaurioituneilla IVD:illä havaittiin lisääntyneitä normalisoituja virumissiirtymiä, mikä viittaa normalisoidun virumisemman jäykkyyden vähenemiseen.

Tulokset osoittavat, että GAG-pitoisuuden vähentäminen vaurioituneissa IVD-laitteissa lisää mekaanista joustavuutta, mutta eEV-hoito estää glykosaminoglykaanien häviämisen ja sitä seuraavat muutokset mekaanisessa toiminnassa.

FOXF1 eEV:t aiheuttivat rakenteellisia ja toiminnallisia muutoksia IVD:ssä lisäämällä proteoglykaani- ja GAG-tasoja.

Tutkimuksen tulokset osoittivat, että kehitykseen liittyviä transkriptiotekijöitä sisältävillä eEV:illä voidaan hoitaa kivuliaita nivelsairauksia, kuten diastolistaalaista nivelkipua (DBP), toimittamalla näitä transkriptiotekijöitä degeneratiivisiin ja kivuliaisiin niveliin IVD:n avulla.

Tämä strategia voi auttaa vähentämään taudin aiheuttamia rakenteellisia ja toiminnallisia poikkeavuuksia ja säätelemään kipuvasteita sukupuolikohtaisella tavalla.

Tutkijat suosittelivat myös kehitykseen liittyvien transkriptiotekijöiden, kuten FOXF1:n, käyttöä degeneratiivisten NP-solujen muuttamiseksi proanaboliseen tilaan in vivo. Lisätutkimuksia tarvitaan sen terapeuttisen tehon määrittämiseksi.