Keinotekoiset sydänläpät

Nykyaikaiset kliiniseen käyttöön saatavilla olevat biologiset keinotekoiset sydänläpät, lukuun ottamatta keuhkojen omasiirrettä, ovat elinkelvottomia rakenteita, joilta puuttuu kasvu- ja kudoskorjauspotentiaali. Tämä asettaa merkittäviä rajoituksia niiden käytölle läppäpatologian korjaamiseksi, erityisesti lapsilla. Kudosteknologia on kehittynyt viimeisten 15 vuoden aikana. Tämän tieteellisen suunnan tavoitteena on luoda keinotekoisissa olosuhteissa rakenteita, kuten keinotekoisia sydänläppävikoja, joilla on tromboresistentti pinta ja elinkelpoinen interstitium.

[ 1 ], [ 2 ]

Miten keinotekoisia sydänventtiilejä kehitetään?

Kudosteknologian tieteellinen käsite perustuu ajatukseen elävien solujen (fibroblastien, kantasolujen jne.) asuttamisesta ja kasvattamisesta synteettisessä tai luonnollisessa absorboituvassa matriisissa, joka on kolmiulotteinen venttiilirakenne, sekä signaalien käyttöön, jotka säätelevät siirrettyjen solujen geenien ilmentymistä, organisoitumista ja tuottavuutta solunulkoisen matriisin muodostumisvaiheen aikana.

Tällaiset keinotekoiset sydänläpät integroidaan potilaan kudokseen niiden rakenteen ja toiminnan lopullista palauttamista ja ylläpitämistä varten. Tässä tapauksessa uusi kollageeni-elastiinirunko tai tarkemmin sanottuna solunulkoinen matriisi muodostuu alkuperäisen matriisin päälle solujen (fibroblastien, myofibroblastien jne.) toiminnan seurauksena. Tämän seurauksena kudosteknologialla luotujen optimaalisten keinotekoisten sydänläppävien tulisi olla anatomisen rakenteen ja toiminnan suhteen lähellä alkuperäistä läppää, ja niillä tulisi olla myös biomekaaninen sopeutumiskyky, kyky korjautua ja kasvaa.

Kudosteknologiassa kehitetään keinotekoisia sydänläppää käyttämällä erilaisia solukeräyslähteitä. Näin ollen voidaan käyttää ksenogeenisiä tai allogeenisiä soluja, vaikka ensin mainittuihin liittyy zoonoosien tarttumisriski ihmisiin. Allogeenisten solujen geneettisellä muokkaamisella on mahdollista vähentää antigeenisuutta ja estää elimistön hylkimisreaktioita. Kudosteknologia vaatii luotettavan solulähteen. Tällainen lähde ovat suoraan potilaalta otetut autogeeniset solut, jotka eivät aiheuta immuunireaktioita uudelleenistutuksen aikana. Tehokkaita keinotekoisia sydänläppää valmistetaan verisuonista (valtimoista ja laskimoista) saatujen autologisten solujen perusteella. Puhtaiden soluviljelmien saamiseksi on kehitetty fluoresenssiaktivoituun solulajitteluun (FACS) perustuva menetelmä. Verisuonesta saatu sekasolupopulaatio leimataan asetyloidulla, matalatiheyksisen lipoproteiinin merkkiaineella, joka absorboituu selektiivisesti endoteelisyyttien pinnalle. Endoteelisolut voidaan sitten helposti erottaa verisuonista saaduista soluista, jotka ovat sileiden lihassolujen, myofibroblastien ja fibroblastien sekoitus. Solujen lähde, olipa kyseessä valtimo tai laskimo, vaikuttaa lopullisen rakenteen ominaisuuksiin. Siten keinotekoiset sydänläpät, joiden matriisiin on kylvetty laskimosoluja, ovat kollageenin muodostumisessa ja mekaanisessa stabiiliudessa parempia kuin valtimosoluilla kylvetyt rakenteet. Perifeeristen laskimoiden valinta näyttää olevan kätevämpi solujen keräyslähde.

Myofibroblasteja voidaan kerätä myös kaulavaltimoista. Verisuonista peräisin olevilla soluilla on kuitenkin merkittävästi erilaisia ominaisuuksia kuin luonnollisilla interstitiaalisoluilla. Autologisia napanuorasoluja voidaan käyttää vaihtoehtoisena solulähteenä.

Kantasoluihin perustuvat keinotekoiset sydänläpät

Viime vuosina kantasolututkimus on edistänyt kudosteknologian kehitystä. Punaisen luuytimen kantasolujen käytöllä on etunsa. Erityisesti biomateriaalin keräämisen ja in vitro -viljelyn yksinkertaisuus sekä sen jälkeinen erilaistuminen erityyppisiksi mesenkymaalisiksi soluiksi mahdollistaa ehjien verisuonten käytön välttämisen. Kantasolut ovat pluripotentteja solulinjojen lähteitä ja niillä on ainutlaatuiset immunologiset ominaisuudet, jotka edistävät niiden vakautta allogeenisissä olosuhteissa.

Ihmisen punaisen luuytimen kantasoluja saadaan rintalastan tai suoliluun harjun punktiolla. Ne eristetään 10–15 ml:sta rintalastan aspiraattia, erotetaan muista soluista ja viljellään. Kun vaadittu solumäärä on saavutettu (yleensä 21–28 päivän kuluessa), ne kylvetään (kolonisoidaan) matriiseille ja viljellään ravintoalustassa staattisessa asennossa (7 päivää kostutetussa inkubaattorissa 37 °C:ssa 5 % CO2:n läsnä ollessa). Seuraavaksi solujen kasvua stimuloidaan kuppimaisen alustan avulla (biologiset ärsykkeet) tai luomalla fysiologiset olosuhteet kudoskasvulle sen isometrisen muodonmuutoksen aikana lisääntymislaitteessa, jossa on sykkivä virtaus – bioreaktori (mekaaniset ärsykkeet). Fibroblastit ovat herkkiä mekaanisille ärsykkeille, jotka edistävät niiden kasvua ja toiminnallista aktiivisuutta. Sykkivä virtaus aiheuttaa sekä säteittäisten että kehämäisten muodonmuutosten lisääntymistä, mikä johtaa asutettujen solujen suuntautumiseen (venymiseen) näiden jännitysten suuntaan. Tämä puolestaan johtaa läppien suuntautuneiden kuiturakenteiden muodostumiseen. Vakiovirtaus aiheuttaa vain tangentiaalisia jännityksiä seinämiin. Pulsoivalla virtauksella on hyödyllinen vaikutus solujen morfologiaan, lisääntymiseen ja solunulkoisen matriisin koostumukseen. Ravinneväliainevirtauksen luonne ja bioreaktorin fysikaalis-kemialliset olosuhteet (pH, pO2 ja pCO2) vaikuttavat myös merkittävästi kollageenin tuotantoon. Siten laminaarivirtaus ja sykliset pyörrevirrat lisäävät kollageenin tuotantoa, mikä johtaa parempiin mekaanisiin ominaisuuksiin.

Toinen lähestymistapa kudosrakenteiden kasvattamiseen on luoda alkio-olosuhteet bioreaktorissa ihmiskehon fysiologisten olosuhteiden simuloinnin sijaan. Kantasolujen pohjalta kasvatetuilla kudosbioläppillä on liikkuvat ja joustavat läpät, jotka kykenevät toiminnallisesti toimimaan korkean paineen ja fysiologista tasoa ylittävän virtauksen vaikutuksesta. Näiden rakenteiden läppien histologiset ja histokemialliset tutkimukset osoittivat aktiivisten matriisin biotuhoamisprosessien läsnäolon ja sen korvaamisen elinkelpoisella kudoksella. Kudos on rakentunut kerrosrakenteen mukaisesti, ja sen solunulkoisten matriisiproteiinien ominaisuudet ovat samanlaiset kuin natiivilla kudoksella, ja siinä on kollageenityyppejä I ja III sekä glykosaminoglykaaneja. Läppien tyypillistä kolmikerroksista rakennetta - kammio-, sieni- ja kuitukerroksia - ei kuitenkaan havaittu. Kaikissa fragmenteissa löydetyillä vimentiiniä ilmentävillä ASMA-positiivisilla soluilla oli samanlaisia ominaisuuksia kuin myofibroblasteilla. Elektronimikroskopia paljasti soluelementtejä, joilla oli elinkelpoisille, erittäville aktiivisille myofibroblasteille ominaisia piirteitä (aktiini-/myosiinifilamentit, kollageenilangat, elastiini), sekä endoteelisoluja kudoksen pinnalla.

Läppäliuskoista havaittiin kollageenityyppejä I ja III, ASMA:ta ja vimentiiniä. Kudos- ja natiivien rakenteiden läppäliuskojen mekaaniset ominaisuudet olivat vertailukelpoiset. Kudostekoiset sydänläpät osoittivat erinomaista suorituskykyä 20 viikon ajan ja muistuttivat luonnollisia anatomisia rakenteita mikrorakenteeltaan, biokemialliselta profiililtaan ja proteiinimatriisin muodostumiseltaan.

Kaikki kudosteknologialla saadut keinotekoiset sydänläpät on istutettu eläimille keuhkoasentoon, koska niiden mekaaniset ominaisuudet eivät vastaa aortta-asennossa aiheutuvia kuormituksia. Eläimiltä irrotetut kudosläpät ovat rakenteeltaan lähellä alkuperäisiä, mikä viittaa niiden jatkokehitykseen ja uudelleenjärjestelyyn in vivo. Jatkotutkimukset osoittavat, jatkuuko kudosten uudelleenjärjestelyn ja kypsymisen prosessi fysiologisissa olosuhteissa keinotekoisten sydänläppävien istutuksen jälkeen, kuten eläinkokeissa havaittiin.

Ihanteellisten tekoläppävien sydänläppävikojen huokoisuuden tulisi olla vähintään 90 %, koska tämä on välttämätöntä solujen kasvulle, ravinteiden kulkeutumiselle ja solujen aineenvaihduntatuotteiden poistumiselle. Biologisen yhteensopivuuden ja biohajoavuuden lisäksi tekoläppävikojen tulisi olla kemiallisesti suotuisa solujen kasvulle ja niiden tulisi vastata luonnollisen kudoksen mekaanisia ominaisuuksia. Matriisin biohajoamisen tason tulisi olla hallittavissa ja verrannollinen uuden kudoksen muodostumisen tasoon mekaanisen stabiilisuuden varmistamiseksi ajan kuluessa.

Tällä hetkellä kehitetään synteettisiä ja biologisia matriiseja. Yleisimmät biologiset materiaalit matriisien luomiseen ovat luovuttajien anatomiset rakenteet, kollageeni ja fibriini. Polymeeripohjaisia tekoläppiä suunnitellaan hajoamaan biologisesti implantaation jälkeen, kun istutetut solut alkavat tuottaa ja järjestää omaa solunulkoista matriisiverkostoaan. Uuden matriisikudoksen muodostumista voidaan säädellä tai stimuloida kasvutekijöillä, sytokiineilla tai hormoneilla.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Luovuttajan tekoläpät

Matriiseina voidaan käyttää ihmisiltä tai eläimiltä saatuja ja soluantigeeneistä desellularisaatiolla niiden immunogeenisyyden vähentämiseksi poistettuja luovuttajien tekoläppäviä. Solunulkoisen matriisin säilötyt proteiinit ovat perusta kylvettyjen solujen myöhemmälle kiinnittymiselle. Seuraavat menetelmät soluelementtien poistamiseksi (soluttomuus) ovat olemassa: pakastaminen, käsittely trypsiini/EDTA:lla, pesuaineet - natriumdodekyylisulfaatti, natriumdeoksikolaatti, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, sekä monivaiheiset entsymaattiset käsittelymenetelmät. Tässä tapauksessa solukalvot, nukleiinihapot, lipidit, sytoplasmarakenteet ja liukoiset matriisimolekyylit poistetaan säilyttäen samalla kollageeni ja elastiini. Ihanteellista menetelmää ei kuitenkaan ole vielä löydetty. Vain natriumdodekyylisulfaatti (0,03-1 %) tai natriumdeoksikolaatti (0,5-2 %) johtivat täydelliseen solujen poistoon 24 tunnin käsittelyn jälkeen.

Eläinkokeessa (koira ja sika) poistettujen soluttomien bioläppävöiden (allosiirteen ja ksenograftin) histologisessa tutkimuksessa havaittiin osittainen endoteelisoituminen ja vastaanottajien myofibroblastien sisäänkasvu tyveen ilman kalkkeutumisen merkkejä. Kohtalaista tulehdusinfiltraatiota havaittiin. Soluttoman SynerGraftTM-läpän kliinisissä kokeissa kehittyi kuitenkin varhainen toimintahäiriö. Bioproteesin matriisissa havaittiin voimakas tulehdusreaktio, joka oli aluksi epäspesifinen ja johon liittyi lymfosyyttinen reaktio. Bioproteesin toimintahäiriö ja rappeutuminen kehittyivät vuoden aikana. Matriisin solukolonisaatiota ei havaittu, mutta läppien kalkkeutumista ja implantaatiota edeltäviä solujäänteitä havaittiin.

Soluvapaat matriisit, joihin oli kylvetty endoteelisoluja ja joita oli viljelty in vitro ja in vivo, muodostivat yhtenäisen kerroksen läppien pinnalle, ja kylvetyt natiivin rakenteen omaavat interstitiaaliset solut osoittivat kykynsä erilaistua. Bioreaktorin dynaamisissa olosuhteissa ei kuitenkaan saavutettu vaadittua fysiologista solujen kolonisaatiotasoa matriisissa, ja implantoituihin keinotekoisiin sydänläppään liittyi melko nopea (kolme kuukautta) paksuuntuminen kiihtyneen solujen lisääntymisen ja solunulkoisen matriisin muodostumisen vuoksi. Näin ollen tässä vaiheessa luovuttajien soluvapaiden matriisien käytöllä niiden kolonisaatioon soluilla on useita ratkaisemattomia ongelmia, mukaan lukien immunologiset ja infektioon liittyvät ongelmat; työ soluttomien bioproteesien parissa jatkuu.

On huomattava, että kollageeni on myös yksi potentiaalisista biologisista materiaaleista biohajoavien matriisien tuotantoon. Sitä voidaan käyttää vaahdon, geelin tai levyjen, sienien ja kuitupohjaisen aihion muodossa. Kollageenin käyttöön liittyy kuitenkin useita teknologisia vaikeuksia. Erityisesti sitä on vaikea saada potilaalta. Siksi tällä hetkellä useimmat kollageenimatriisit ovat eläinperäisiä. Eläinkollageenin hidas biohajoaminen voi lisätä zoonoosien tartuntariskiä ja aiheuttaa immunologisia ja tulehduksellisia reaktioita.

Fibriini on toinen biologinen materiaali, jolla on kontrolloidut biohajoamisominaisuudet. Koska fibriinimeeleitä voidaan valmistaa potilaan verestä autologisen matriisin myöhempää tuotantoa varten, tällaisen rakenteen implantointi ei aiheuta sen myrkyllistä hajoamista eikä tulehdusreaktiota. Fibriinillä on kuitenkin haittoja, kuten diffuusio ja huuhtoutuminen ympäristöön sekä heikot mekaaniset ominaisuudet.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Synteettisistä materiaaleista valmistetut keinotekoiset sydänläpät

Keinotekoisia sydänläppäventtiilejä valmistetaan myös synteettisistä materiaaleista. Useat yritykset valmistaa läppämatriiseja ovat perustuneet polyglaktiiniin, polyglykolihapoon (PGA), polymaitohapoon (PLA), PGA- ja PLA-kopolymeeriin (PLGA) sekä polyhydroksialkanoaatteihin (PHA). Erittäin huokoista synteettistä materiaalia voidaan saada punotusta tai punomattomasta kuidusta ja käyttämällä suolaliuotustekniikkaa. Lupaava komposiittimateriaali (PGA/P4HB) matriisien valmistukseen saadaan punomattomista polyglykolihapon (PGA) silmukoista, jotka on päällystetty poly-4-hydroksibutyraatilla (P4HB). Tästä materiaalista valmistetut keinotekoiset sydänläpät steriloidaan etyleenioksidilla. Näiden polymeerien silmukoiden merkittävä alkuperäinen jäykkyys ja paksuus, niiden nopea ja hallitsematon hajoaminen, johon liittyy happamien sytotoksisten tuotteiden vapautuminen, vaativat kuitenkin lisätutkimuksia ja muiden materiaalien etsimistä.

Autologisten myofibroblastikudosviljelylevyjen käyttö tukirakenteilla näiden solujen tuotantoa stimuloimalla tukimatriisien muodostamiseksi on mahdollistanut sellaisten läppänäytteiden saamisen, joissa on aktiivisia, elinkelpoisia soluja ja joita ympäröi solunulkoinen matriisi. Näiden läppien kudosten mekaaniset ominaisuudet ovat kuitenkin vielä riittämättömät niiden implantointiin.

Luotavan läpän vaadittua proliferaation ja kudosregeneraation tasoa ei välttämättä saavuteta pelkästään yhdistämällä soluja ja matriisia. Solujen geenien ilmentymistä ja kudosmuodostusta voidaan säädellä tai stimuloida lisäämällä kasvutekijöitä, sytokiineja tai hormoneja, mitogeenisiä tekijöitä tai adheesiotekijöitä matriiseihin ja tukirakenteisiin. Näiden säätelijöiden lisäämistä matriisibiomateriaaleihin tutkitaan parhaillaan. Kaiken kaikkiaan biokemiallisten ärsykkeiden vaikutusta kudosläpän muodostumisen säätelyyn tutkitaan merkittävästi.

Sian ksenogeeninen keuhkobioproteesi Matrix P koostuu soluttomasta kudoksesta, joka on käsitelty AutoTissue GmbH:n erityisellä patentoidulla menetelmällä, johon kuuluu antibiootti-, natriumdeoksikolaat- ja alkoholikäsittely. Tämä Kansainvälisen standardisoimisjärjestön hyväksymä käsittelymenetelmä poistaa kaikki elävät solut ja postsellulaariset rakenteet (fibroblastit, endoteelisolut, bakteerit, virukset, sienet, mykoplasma), säilyttää solunulkoisen matriisin rakenteen, vähentää DNA:n ja RNA:n määrää kudoksissa minimiin, mikä vähentää nollaan sian endogeenisen retroviruksen (PERV) siirtymisen todennäköisyyttä ihmisiin. Matrix P -bioproteesi koostuu yksinomaan kollageenista ja elastiinista, joiden rakenteellinen integraatio on säilynyt.

Lammaskokeissa ympäröivien kudosten reaktiot havaittiin minimaalisesti 11 kuukautta Matrix P -bioproteesin asennuksen jälkeen, ja eloonjäämisasteet olivat hyvät, mikä oli erityisen ilmeistä sydämen sisäkalvon kiiltävässä sisäpinnassa. Tulehdusreaktiot, läppäläppäjen paksuuntuminen ja lyheneminen olivat käytännössä poissa. Matrix P -bioproteesissa havaittiin myös alhaisia kudoskalsiumpitoisuuksia, ja ero oli tilastollisesti merkitsevä verrattuna glutaraldehydillä hoidettuihin.

Matrix P -keinotekoinen sydänläppä sopeutuu yksittäisen potilaan olosuhteisiin muutaman kuukauden kuluessa implantaatiostaan. Kontrollijakson lopussa tehdyssä tutkimuksessa havaittiin ehjä solunulkoinen matriisi ja yhtynyt endoteeli. Matrix R -ksenografti, joka implantoitiin 50 synnynnäisiä vikoja sairastavalle potilaalle Ross-toimenpiteen aikana vuosina 2002–2004, osoitti parempaa suorituskykyä ja alhaisempia transvalvulaarisia painegradientteja verrattuna kryosäilytettyihin ja soluttomiin SynerGraftMT-allosiirteisiin ja glutaraldehydillä käsiteltyihin tukirakenteisiin bioproteeseihin. Matrix P -keinotekoiset sydänläpät on tarkoitettu keuhkoläppäleikkaukseen oikean kammion ulosvirtauskanavan rekonstruktion aikana synnynnäisten ja hankittujen vikojen leikkauksissa sekä keuhkoläppäleikkauksen aikana Ross-toimenpiteen aikana. Niitä on saatavana neljässä koossa (sisähalkaisijan mukaan): vastasyntyneille (15–17 mm), lapsille (18–21 mm), keskikokoisille (22–24 mm) ja aikuisille (25–28 mm).

Kudosteknologisesti valmistettujen läppien kehityksen edistyminen riippuu läppäsolubiologian edistyksestä (mukaan lukien geenien ilmentymiseen ja säätelyyn liittyvät kysymykset), alkionkehityksen ja ikään liittyvän läpän kehityksen tutkimuksista (mukaan lukien angiogeeniset ja neurogeeniset tekijät), kunkin läpän biomekaniikan tarkasta tuntemuksesta, sopivien solujen tunnistamisesta siementä varten ja optimaalisten matriisien kehittämisestä. Edistyneempien kudosläppäjen jatkokehitys edellyttää perusteellista ymmärrystä natiivien läppien mekaanisten ja rakenteellisten ominaisuuksien sekä näiden ominaisuuksien uudelleenluomiseen in vitro käytettävien ärsykkeiden (biologisten ja mekaanisten) välisestä suhteesta.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]